超临界二氧化碳萃取黄榆籽油工艺及抗疲劳活性研究

潘 迪 马挺军

(北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206)

黄榆(Ulmusmacrocarpa)为榆科榆属落叶乔木或灌木植物，高达20 m，胸径30 cm，分布于我国东北及华北、西北部分省区，朝鲜、俄罗斯也有分布[1]。作为防护林工程的优良树种之一，黄榆可防风固沙、固土保水、城市绿化，不仅生态价值巨大，还具有较高的药用价值。研究表明黄榆提取物具有抗肿瘤、抗过敏[2]、抗氧化、抗皮肤衰老[3]、抗高脂血[4]、免疫[5]等药理功效。本实验室测得黄榆籽中，脂肪含量9.44 g/100 g，蛋白质23.5 g/100 g，总糖(以葡萄糖计)4 g/100 g，灰分3.65 g/100 g，水分及挥发物5.044 g/100 g。因此，黄榆籽油具有广阔的开发前景。

植物油的提取方法有压榨法[6]，浸提法[7]，超声波辅助法[8]，水酶法[9]等，虽然都取得了一定效果，但压榨法出油率低、浸提法和超声辅助法存在溶剂残留、水酶法酶的选择性高等缺点。而超临界二氧化碳萃取法可以克服上述提取方法的不足，它是在超临界状态下使用二氧化碳作为溶剂，可以在较低的温度下进行萃取，不会对热敏性物质产生影响，更不会引起部分物质的氧化，具有绿色、无毒、无溶剂残留、萃取率高、操作简便等优点，但该方法仪器设备昂贵，且相关理论及技术要求较高，不适合大规模工业化生产，目前也仅用作小油种提取油脂的中试和小批量生产[10-12]。高妮娜等[13]比较了压榨法、溶剂浸提法、水酶法和超临界CO2萃取法对奇亚籽油品质特性的影响，结果发现超临界CO2萃取法的油脂得率最高(85.5%)，其次是溶剂浸提法(65.8%)和压榨法(40.9%)，水酶法最低(33.2%)。阿吉姑·阿布都热西提等[14]采用正交实验优化了萃取压力、温度、CO2流量和萃取时间对巴旦杏仁油超临界CO2萃取得率的影响，结果表明萃取压力35 MPa、萃取温度40 ℃、二氧化碳流量6 L/min、萃取时间4 h 为最优条件，在此条件下巴旦杏仁油萃取得率达到43.10%。Achicanoy等[15]采用超临界二氧化碳萃取番茄籽油，得到的最佳萃取条件为压力38.1 MPa，温度64 ℃，萃取率为21.07%。故本实验采用超临界二氧化碳萃取黄榆籽油。

剧烈运动会增加能量消耗，加速活性氧的积累，导致氧化应激和脂质过氧化而产生身体疲劳[16]。而补充具有抗氧化能力的物质，可以提高抗氧化酶活性，从而延长运动能力，减少身体疲劳[17]。有文献报道，油脂中的亚油酸、亚麻酸和油酸等不饱和脂肪酸，具有抗氧化、降血脂、增强免疫力等功效[18]。此外，植物油脂中的活性成分如植物甾醇、生育酚、黄酮类、多酚类等，也具有抗氧化、抗衰老活性[19]。黄榆籽油作为新型的植物油脂，也受到了关注，但目前国内对黄榆籽油体内抗疲劳、抗氧化作用的研究鲜见报道。本实验以黄榆籽为原料，采用超临界二氧化碳萃取黄榆籽油，在单因素的基础上采用正交试验，研究萃取压力、萃取温度、萃取时间对黄榆籽油萃取率的影响；然后对在此条件下萃取的黄榆籽油进行理化性质分析；并将其灌喂小鼠，通过小鼠负重游泳实验，分析小鼠体内抗疲劳、抗氧化活性，以期为黄榆籽油的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄榆籽采自吉林省国家级向海自然保护区蒙古黄榆树林(内蒙古科尔沁保护区黄榆林5，6月(该树一般两年结一次果，果熟5-6月)；CO2纯度99.99%，食用级；色拉油 Aceties Monterreal S.A；香菇多糖片；鼠维持颗粒饲料 生产许可证号：SCXK(京)2019-0012；尿素氮测定试剂盒(BUN)、乳酸试剂盒(LA)、肝糖试剂盒(LG)、丙二醛试剂盒(MDA)、超氧化物歧化酶试剂盒(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(GSH-Px)；氢氧化钠、甲醇、三氟化硼均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PE AutoSystem XL-TurbeMass GC/MS联用仪，毛细管色谱柱为SE254型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，超临界流体萃取系统，UV-1601PC型可见紫外分光光度计，雷杜Chemray360全自动生化分析仪，HD型单列恒温水浴锅，小鼠笼具规格300 mm×180 mm×130 mm，材质为PC聚碳酸酯。

1.3 动物

雄性ICR小鼠 60只，起始体重(17.9±1.0)g，6周龄，动物生产许可证号：SCXK(京)2019-0009。

实验小鼠被圈养在笼子里，每笼6只。在恒温(20～25 ℃)和湿度50%～70%下，每日12 h/12 h光/暗交替照明(早上8点到晚上8点光照)，并且小鼠在SPF(特异性无病原体)动物饲养室内可自由食用标准饲料和无菌饮用水。

1.4 实验方法

1.4.1 黄榆籽油的超临界流体萃取

参考王玉玲等[20]的方法，取清理去杂后的黄榆籽，在干燥箱中于105 ℃烘烤2 h后粉碎，过60目筛子，备用。准确称取一定量的黄榆籽粉投入萃取釜中，调节系统的温度、压力至设定值，CO2流量为2.5 L/min，然后进行循环萃取。当达到设定时间后，从出料口收集产物并计算萃取率，每组实验重复3次，取平均。按下式计算黄榆籽油的萃取率。

萃取率=(萃取的黄榆籽油质量/黄榆籽粉质量)×100%

1.4.2 单因素实验

按照1.4.1的实验方法，以黄榆籽油萃取率为试验指标，分别考察萃取压力(10、20、30、40、50、60 MPa)、萃取温度(10、20、30、40、50、60 ℃)、萃取时间(30、60、90、120、150 min)对黄榆籽油萃取率的影响，采用控制变量法，确定各个因素的大致范围。

1.4.3 正交试验

在单因素试验的基础上，选取萃取压力(A)、萃取温度(B)、萃取时间(C)为考察因素，每个因素选取3个水平，萃取率为考察指标，采用L9(34)正交表进行试验。具体因素水平值见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.4.4 黄榆籽油的理化性质分析

酸价按GB 5009.229—2016测定，过氧化值按GB 5009.227—2016测定，碘值按GB/T 5532—2008测定，皂化值按GB/T 5534—2008 测定，水分及挥发值含量按GB 5009.236—2016测定。

1.4.5 抗疲劳、抗氧化实验

1.4.5.1 动物分组及饲喂

适应性喂养1周后，根据体重将小鼠随机分为5组，每组12只：正常对照组(NC)、阳性对照组(PC)、低剂量组(LD)、中剂量组(MD)和高剂量(HD)。样品低、中、高剂量组每只小鼠每天分别灌胃黄榆籽油2.5、5、10 mL/kg(以体质量bw计，下同)；正常对照组小鼠每只每天灌喂等量色拉油10 mL/kg；阳性对照组小鼠每只每天灌喂香菇多糖300 mg/kg。每日1次，连续28 d，灌胃期间自由取食和饮水。

不同剂量黄榆籽油的配制方法：高剂量直接应用黄榆籽油原油，中、低剂量组用色拉油稀释配制，用时搅拌器混匀。密封，4 ℃冰箱贮藏，备用；使用时充分摇匀，每次给药剩余药液废弃。

1.4.5.2 小鼠力竭游泳实验

参考马挺军等[21]的方法，小鼠负重游泳实验如下：末次给药1 h后，在小鼠尾部负小鼠体重5%的铅皮，投入水温为(27±0.5) ℃，水深40 cm的游泳箱中游泳，从放入小鼠开始计时，至小鼠沉于水面下10 s后不能浮出水面的时间作为力竭游泳时间，观察并记录小鼠的力竭游泳时间。

1.4.5.3 抗疲劳生化指标测定

参考Xia等[22]方法并进行修改，小鼠负重游泳1 h后，眼球采血，血凝固后2 000 r/min离心15 min，取血清冻存，用于测定血尿素氮(BUN)、血乳酸(LA)。之后立即处死小鼠，取其肝脏，经冰冻生理盐水漂洗后用滤纸吸干，用于测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和肝糖原(LG)含量。其中，BUN用全自动生化分析仪测定，其他指标均按照试剂盒进行操作。

1.5 数据分析

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 萃取压力对黄榆籽油萃取率的影响

从图1可以看出，萃取压力在10～30 MPa范围内，随着萃取压力的增加，黄榆籽油的萃取率逐渐增大，达到30 MPa时萃取率达到最大值40.89%。这是因为萃取压力升高，CO2密度增大，从而对溶质溶解性能增加，有利于萃取[23]。当萃取压力超过30 MPa时，黄榆籽油的萃取率没有明显变化。在实际生产过程中，萃取压力过大会导致企业的经营成本和设备投资明显增加。综合考虑，选择萃取压力为30 MPa。

图1 萃取压力、萃取温度、萃取时间对黄榆籽油萃取率的影响

2.1.2 萃取温度对黄榆籽油萃取率的影响

由图1可知，随着萃取温度的升高，黄榆籽油的萃取率先增大后减小。当萃取温度为40 ℃时，萃取率达到最大值。这可能是因为萃取温度的升高，蒸汽压增大，使分子间热运动加剧，提高了黄榆籽油在CO2中的溶解度进而萃取速率提高；但是温度升高还会导致CO2流体的密度降低，从而降低了黄榆籽油溶解度[24]。因此，确定了最佳萃取温度为40 ℃。

2.1.3 萃取时间对黄榆籽油萃取率的影响

如图1所示，随着萃取时间延长，黄榆籽油萃取率逐渐增大。这是因为萃取刚开始时，超临界二氧化碳流体与黄榆籽接触的较少，萃取率低，随着时间延长，两者充分接触导致萃取率增大。当萃取时间超过120 min后，黄榆籽油的萃取率趋于平缓。这是由于黄榆籽油大部分被萃取出来，萃取时间继续延长会导致能耗增大。所以选择萃取时间为120 min。

2.2 正交实验

从表2可以看出，各因素对黄榆籽油萃取率的影响顺序为：萃取压力>萃取时间>萃取温度(A>C>B)。根据表3的方差分析结果，萃取压力(A)对超临界二氧化碳萃取黄榆籽油的萃取率有显著影响，萃取温度(B)和萃取时间(C)对黄榆籽油萃取率影响不显著。综合分析正交实验结果，确定最佳工艺条件为A2B3C2，即萃取压力为30 MPa，萃取温度为50 ℃，萃取时间为120 min，通过实验验证，该条件下的萃取率为45.26%。

表2 L9(34) 正交实验结果

表3 方差分析表

2.3 黄榆籽油的理化性质

GB 2716—2018规定：食用植物油的酸价(KOH)≤3 mg/g，过氧化值≤0.25 g/100 g。由表4可知，超临界二氧化碳萃取的黄榆籽油的酸价为3 mg/g，过氧化值0.052 g/100 g，符合食用植物油标准。

表4 黄榆籽油品质分析

2.4 黄榆籽油抗疲劳、抗氧化实验

2.4.1 黄榆籽油对小鼠力竭游泳时间的影响

力竭游泳时间是小鼠运动能力的体现，也是抗疲劳试验指标之一。近年来，药用植物多糖被认为是一种新型的天然抗疲劳剂，故选择香菇多糖作为阳性对照组。由图2可知，与NC组相比，各组小鼠力竭游泳时间均延长。LD、MD组均延长不显著；HD、PC组均延长极显著(P<0.01)，分别延长了4.67倍、20.37倍。以上结果表明，香菇多糖和黄榆籽油均可延长小鼠的力竭游泳时间，在不同剂量组黄榆籽油中高剂量组效果最好。

注：NC-空白，PC-香菇多糖组。*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同。图2 黄榆籽油对小鼠力竭游泳时间的影响

2.4.2 黄榆籽油对小鼠BUN、LA、LG含量的影响

血尿素氮BUN是蛋白质和氨基酸的代谢产物，当身体不能从碳水化合物和脂肪中获得能量时，蛋白质和氨基酸就成为分解代谢的替代来源，以满足能量需求，因此BUN含量升高导致机体产生疲劳[25]。此外，长时间的运动还会增加肌肉的耗氧量，进而导致缺氧，加速糖酵解，产生大量的酸性物质，如乳酸和丙酮；而乳酸的积累会使肌肉和血液的pH降低，直接或间接导致肌肉运动能力下降，造成运动性疲劳[26，27]。由图3可知，与NC组相比，各组的BUN、LA含量均有所降低，HD组小鼠的BUN、LA含量显著降低(P<0.05)，分别降低了17.11%、24.37%；PC组小鼠的LA含量显著下降了27.97%(P<0.05)，而其他各组小鼠的BUN、LA含量无显著性差异。结果说明，黄榆籽油在高剂量下能有效抑制血尿素氮和乳酸的产生，延缓疲劳的发生，与香菇多糖效果相一致。

图3 黄榆籽油对小鼠BUN、LA、LG含量的影响

肝糖原是运动过程中重要的能量来源，它可以被分解转化成葡萄糖，为机体运动提供更多的能量，从而延缓运动疲劳的产生[28]。由图3可见，与NC组相比，各剂量组小鼠的LG含量均有所升高，其中，PC组小鼠的LG含量极显著升高(P<0.01)，而黄榆籽油剂量组中随着剂量的增加，小鼠的LG含量逐渐升高，在HD组时达到显著水平(P<0.05)，并且比PC组提高了24.04%。这说明黄榆籽油可提高小鼠体内肝糖原的含量，且高剂量组黄榆籽油的作用效果优于香菇多糖。

2.4.3 黄榆籽油对小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影响

MDA是脂质过氧化的产物，MDA含量降低，可以减轻氧化应激，改善运动性疲劳[29]。SOD和GSH-Px是生物体内重要的抗氧化酶，可清除积累的氧自由基，维持体内平衡，减弱活性氧的作用，从而保护细胞结构不受破坏，防止疲劳的发生[30]。由表5知，与NC组相比，各剂量组MDA含量均有所降低，PC组显著降低(P<0.05)，LD、MD组降低不显著，HD组极显著降低(P<0.01)；与NC组相比，各剂量组SOD和GSH-Px活力均有所升高，其中，SOD活力在HD组升高极显著(P<0.01)，而在其余各组均无显著性差异；GSH-Px活力在MD、HD组均显著提高(P<0.05)，在PC组极显著提高(P<0.01)。这表明，黄榆籽油可以提高小鼠体内抗氧化酶活性，防止过度运动引起的氧化应激，降低氧化损伤。随着黄榆籽油剂量的增加，其作用效果越显著，甚至优于香菇多糖。

表5 黄榆籽油对小鼠MDA、SOD、GSH-Px含量的影响

3 结论

通过单因素和正交实验设计，超临界二氧化碳萃取黄榆籽油的最佳工艺为萃取压力30 MPa、萃取温度50 ℃、萃取时间120 min，在此条件下黄榆籽油油萃取率为45.26%。

对萃取的黄榆籽油进行理化实验分析，酸价为3 mgKOH/g、过氧化值为0.052 g/100 g、碘值为7.8 gI/100 g、皂化值为300 mg/g、水分及挥发物含量为3.51 g/100 g。本试验测得的油脂的各项指标均在食用油标准范围之内，所以黄榆籽可以作为开发食用油的新食品原料。

与对照组相比，黄榆籽油高剂量组可显著延长小鼠游泳时间(P<0.05)，降低BUN、LA含量(P<0.05)，并提高LG含量(P<0.05)；同时，显著提高SOD、GSH-Px活力(P<0.05或P<0.01)，降低MDA水平(P<0.01)。表明黄榆籽油具有良好的抗疲劳、抗氧化活性，且其活性与黄榆籽油剂量呈正相关，达到高剂量组时活性最强。