生防菌KD-16J的鉴定及其对番茄灰霉病的抑制作用

王笑笑，季小诗，刘芳，赵月，郭红莲

（天津科技大学食品科学与工程学院，天津 300457）

番茄，又名西红柿，其味道酸甜可口，富含维生素、番茄红素以及多种微量元素，具有极高的营养保健作用，有“蔬菜中的水果”之称[1]，2018年全球种植面积达到4.76×106hm2[2]。然而，番茄在贮运期间由于机械损伤、植物组织衰老等处于易受各种真菌侵染的状态[3]，经常造成大量经济损失。其中，引发果实灰霉病的灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）是最具破坏性的真菌之一[4-5]，严重制约着番茄果实贮运和保鲜业的发展。尽管化学合成杀菌剂是目前最有效、最常用的控制采后病害的方法，但毒性更小、更不易产生抗药性的生物防治技术近年来更加受到人们的青睐，尤其是将酵母作为拮抗剂应用到采后果蔬中[6-7]。

拮抗酵母菌能够通过营养和空间的竞争、重寄生、分泌抑菌物质和提高宿主的抗性等[8]作用方式对多种植物病原菌产生抑制作用，目前已被国内外研究人员广泛关注。Zhang等[9]分离筛选出了一株对梨青霉病具有很好防治的菌株，经鉴定为异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）；Meng 等[10]发现在葡萄采前喷施罗伦隐球酵母（C.laurentii）并结合壳聚糖的使用，可有效防止葡萄腐烂变质；Paiva等[11]发现酵母菌与气调包装联合应用对樱桃果实采后青霉病具有一定的抑制效果。除此之外，研究人员还发现毕赤酵母对苹果采后青霉病及番茄采后根霉果腐病具有很好的抑制作用[12-14]，膜醭毕赤酵母和壳聚糖复合处理对柑橘果实炭疽病具有很好的抑制作用[15]。

本文通过形态学鉴定、生理生化以及内源转录间隔区（internally transcribed spacer，ITS）序列分析对菌株KD-16J进行鉴定，并以该菌株为出发菌株，研究其在离体平板和番茄果实上对灰葡萄孢菌的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄：选取大小一致、色泽饱满、无机械损伤和病虫害的番茄果实作为试验材料，清洗后用2%（体积分数）次氯酸钠进行消毒（浸泡2 min），自来水充分冲洗2 min，放置在通风处晾干备用。

灰葡萄孢菌：按组织分离法[16]从具有灰霉病的番茄上分离纯化和保存。

生防菌KD-16J：天津科技大学农产品物流保鲜与加工研究室提供，经ICR小鼠毒性经口试验无急性毒性。

琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、蔗糖、尿素、硫酸铵、硝酸铵、（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司；乳糖（分析纯），天津市大茂化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

立式圧力蒸气灭菌锅（YXQ-LS-500）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；超净操作台（ZHJH-CII09B）：上海智城分析仪器制造有限公司；迷你双垂直电泳仪（DZCZ-24DN）：鼎国生物技术有限公司；基因扩增仪（BLD8-PCR-2）：珠海黑马医学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 生防菌KD-16J的鉴定

1.3.1.1 生防菌KD-16J形态特征观察

参照马岩石等[17]的方法，观察生防菌KD-16J在PDA液体和固体培养基中的形态特征。

1.3.1.2 生防菌KD-16J生理生化试验鉴定

参照《微生物学实验技术》[18]对菌株KD-16J进行糖酵解、碳源同化、氮源同化以及生长温度等生理生化反应鉴定。

1.3.1.3 生防菌KD-16J ITS序列分析

提取生防菌KD-16J的基因组DNA，聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增该菌株的ITS序列区域[19]。将纯化后的PCR产物交给上海生工有限公司进行测序，利用BLAST程序进行相似序列搜索，下载同源性较高的序列，通过MEGA 7.0构建分子进化树。

1.3.2 生防菌KD-16J对灰霉病菌的离体抑制作用

1.3.2.1 不同浓度生防菌KD-16J对灰霉菌丝生长的影响

参照余巧银等[20]的方法进行。将培养7 d的灰葡萄孢菌边缘用打孔器接种到含不同浓度生防菌KD-16J的平板上，在25℃培养箱内恒温培养。每天从平板背面观察，采用十字交叉法测量病原菌的菌落直径，计算抑菌率。每组处理重复3次。

1.3.2.2 不同浓度生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌孢子萌发的影响

参照Zhang等[9]的方法，将灰葡萄孢菌的孢子悬浮液分别加入含不同浓度生防菌KD-16J的液体PDA中，置于25℃、150 r/min条件下恒温振荡培养，每隔4 h在光学显微镜下测定孢子萌发率。试验重复3次。孢子萌发率按照以下公式进行计算（以孢子芽管长度超过孢子长径视为萌发）。

1.3.2.3 生防菌KD-16J对灰霉菌抑制作用的显微镜观察

将培养7 d的灰葡萄孢边缘用打孔器接种到含1×108CFU/mL酵母细胞的PDA平板上，以含无菌水的PDA平板作为对照组，5 d后分别挑取灰霉菌丝进行显微观察。

1.3.3 生防菌KD-16J对番茄灰霉病的生防效果

1.3.3.1 生防菌KD-16J对番茄采后病害自然侵染的防效

将1×108CFU/mL的酵母细胞悬液喷洒在已经经过预处理的番茄果实上，以无菌水组作为对照组，25℃条件下贮藏12 d，计算果实发病率。每次试验处理10个果实，试验重复3次。

1.3.3.2 生防菌KD-16J对有伤接种灰葡萄孢菌果实的防效

参照程雷等[21]的方法并修改，在经过预处理的番茄果实上的腰部用无菌打孔器打两个孔（长5 mm，深约3 mm）。自然晾干后分别喷洒浓度为1×108CFU/mL的酵母细胞悬液和无菌蒸馏水，然后向每孔中定量注入10 μL浓度为1×105个/mL的灰葡萄孢菌孢子悬液。待菌液吸收后，使用保鲜袋进行单果包装，外罩保鲜膜以保持90%～95%左右的相对湿度，于25℃室温条件下贮藏。每隔24 h进行果实发病率的观察测定。每次试验处理10个果实，试验重复3次。

1.3.3.3 生防菌KD-16J不同处理时间对番茄灰霉病害的防治效果

对经过预处理的番茄果实进行打孔处理，在接种灰霉菌孢子悬浮液之前的36、24、12、0 h以及接种孢子悬浮液之后的12、24、48 h，分别对果实进行喷施浓度为1×108CFU/mL的酵母细胞悬液，以无菌水的处理作为对照，检测果实发病率和病斑直径。每组处理3个果实，试验重复3次。

1.3.4 生防菌KD-16J在番茄果实伤口处生长动态的测定

参照1.3.3.2的实验组的方法处理番茄果实，以接种l h后测定的生防菌KD-16J数目为起始值，每24 h取样测定1次果实伤口处的酵母数。参照赵妍[22]的方法，用打孔器挖下伤口，放入盛有无菌磷酸盐缓冲液的研钵之中，研磨成匀浆。用无菌水进行梯度稀释，采用涂布平板法涂布于PDA平板上，培养48 h后测定拮抗酵母的数目。每组处理3个果实，试验重复3次。

1.4 数据处理与分析

试验数据处理采用SPSS 17.0分析软件进行方差分析和邓肯氏多重比较法在P=0.05的水平下进行检验，Excel 2016分析并制图。

2 结果与分析

2.1 生防菌KD-16J的鉴定

2.1.1 菌株KD-16J形态观察

菌株KD-16J形态观察如图1所示。

图1 菌株KD-16J平板培养的菌落特征Fig.1 Colony characteristics of the strain KD-16J on potato dextrose agar

菌株KD-16J菌落在PDA平板上呈乳白色奶酪状，表面平滑湿润有光泽，质地黏稠，具有芳香味，前期菌落边缘较整齐饱满，后期菌落边缘成发散性树状分枝。在液体培养基静置培养会产生一层质地湿润平滑的醭膜。

2.1.2 菌株KD-16J生理生化鉴定

对生防菌进行生理生化鉴定，其结果如表1所示。

KD-16J菌株在厌氧条件下发酵葡萄糖、蔗糖，但不发酵乳糖和可溶性淀粉。在有氧条件下可以同化葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉以及硝酸铵、硫酸铵、尿素。在低温4℃下不生长，50℃时出现弱生长现象，高温达到70℃也不再生长。

2.1.3 ITS结果分析与发育树的构建

将测序结果通过BLAST分析，选取相似度较高的序列进行发育树的构建，如图2所示。

由图2可知，该株拮抗菌与膜醭毕赤酵母菌（Pichia membranifaciens）的亲缘关系最近，结合形态和生理生化鉴定可确定生防菌KD-16J是膜醭毕赤酵母菌。

2.2 生防菌KD-16J对灰霉病菌的离体抑制作用

2.2.1 生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌菌丝生长的影响

将灰葡萄孢菌接种到含不同浓度生防菌KD-16J的培养基上，生长情况见图3。

图3（a）可以明显看出，不含生防菌KD-16J的对照组的灰霉菌落长得非常迅速，试验组的病原菌得到了明显的抑制。图3（b）表明生防菌KD-16J浓度越高，对灰葡萄孢菌的抑制率越大。1×107CFU/mL和1×108CFU/mL的生防菌KD-16J处理下的灰霉菌落抑制率高达77.89%和85.53%，抑制作用显著（P＜0.05）。

2.2.2 生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌孢子萌发的影响

生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌孢子萌发的影响见图4。

如图4所示，浓度为1×105CFU/mL的生防菌KD-16J处理的灰霉孢子的萌发率在初始阶段要低于对照组，但随着时间的延长，其萌发率会逐渐增大。当生防菌的浓度为1×107CFU/mL时，萌发率显著降低，最大值仅为22.5%，当用浓度为1×108CFU/mL的生防菌KD-16J溶液处理时，对孢子萌发的抑制率基本达到了100%，即使在培养36 h甚至48 h之后，仍没有明显的孢子萌发现象。因此，生防菌KD-16J的最佳抑菌浓度为 1×108CFU/mL。

图2 生防菌KD-16J系统发育树的构建Fig.2 Construction of phylogenetic tree of biocontrol strain KD-16J

图3 不同浓度生防菌KD-16J悬液对灰葡萄孢菌生长的影响Fig.3 Inhibiting effects of various cell suspension concentration of strain KD-16J on colony diameter of B.cinerea

图4 不同浓度生防菌KD-16J悬液处理对灰霉菌孢子萌发的影响Fig.4 Effect of various cell suspension concentration of the strain KD-16J on spore germination of B.cinerea

2.2.3 生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌抑制作用的显微镜观察

生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌抑制作用的显微镜观察结果见图5。

图5 生防菌KD-16J与灰葡萄孢菌在40倍显微镜下的相互作用观察Fig.5 The interactions observed of the strain KD-16J and Botrytis cinerea with forty times electron microscope

如图5（a）所示，对照组的菌丝生长相对规则粗壮、表面光滑，菌丝致密、簇拥成团，菌丝隔清晰易辨，菌丝细胞内容物饱满且分布均匀；而试验组菌丝周围紧密附着生防菌，且菌丝分枝处密度相对较高，菌丝生长粗细不均，杂乱无序，菌丝钝化现象明显，菌丝出现内容物逐渐凝聚、空泡化，甚至出现渗漏等现象。

2.3 生防菌KD-16J对番茄灰霉病的生防效果

2.3.1 生防菌KD-16J对番茄采后病害自然侵染的防效

生防菌KD-16J对番茄采后病害自然侵染的防效如图6所示。

图6 生防菌KD-16J对番茄果实自然病害发病率的防治效果Fig.6 The control effects of the strain KD-16J on the disease incidence of naturally infection of tomato fruit

在番茄果实贮藏前，对其喷施1×108CFU/mL的生防菌KD-16J悬液，自然病害的发生机率较之对照组可以得到显著降低（P＜0.05）。

贮藏第6天，和对照组的5.14%相比，拮抗酵母处理仍可以完全防治自然病害的发生。直至贮藏的第12天，与对照组的发病率为49.97%相比，喷施拮抗酵母处理的番茄果实自然病害发生率仅为16.67%，防治效果明显。

2.3.2 生防菌KD-16J对番茄灰霉病有伤接种侵染的防效

生防菌KD-16J悬液喷洒处理对番茄灰霉病的抑制效果见图7。

图7 生防菌KD-16J悬液喷洒处理对番茄灰霉病的抑制效果Fig.7 Inhibition effect of strain KD-16J suspension spraying on tomato gray mold

如图7所示，提前喷洒生防菌KD-16J悬液的采后番茄灰霉病害发病率显著低于对照组（P＜0.05）。贮藏初期，对照组果实发病率快速增加，至贮藏第5天，所有对照组的果实已经完全发病，而喷洒处理的拮抗酵母由于在番茄果实表面快速繁殖生长，起到很好的防治效果，因而贮藏初期试验组果实的发病率较低，至贮藏第5天拮抗酵母处理组发病率仅为57.12%，到贮藏结束仍没有达到完全发病。

2.3.3 生防菌KD-16J的不同喷洒时间对番茄灰霉病害的防治效果

生防菌KD-16J的不同喷洒时间对番茄灰霉病害的防治效果见图8。

图8 生防菌KD-16J的不同喷洒时间对番茄灰霉病害的防治效果Fig.8 The inhibiting effects of application times of the strain KD-16J on tomato gray mold disease

如图8（a）所示，通过测量计算番茄伤口处的发病率和病斑直径，发现生防菌喷洒时间对番茄果实的灰霉病斑直径影响显著。如图8（b）所示，至贮藏期结束，生防菌KD-16J先于灰霉菌36 h处理时，其发病率仅为29.12%，病斑直径平均仅为6 mm，显著低于对照组（P＜0.05）。随着生防菌KD-16J喷洒时间的延迟，番茄果实发病率会逐渐增加，生防菌喷洒时间晚于灰霉菌48 h的番茄果实至贮藏期结束则已完全发病，番茄果实的病斑直径也随之增大。根据Filonow等[23]的研究表明，拮抗酵母菌能够从果汁或糖溶液中快速消耗糖，利用糖类物质比灰葡萄孢菌更具优势，所以将生防菌KD-16J和灰霉菌同时接种到番茄果实上，酵母菌利用糖类的速度比病原菌快，可以在短时间内利用果实伤口处的营养迅速繁殖，抢占生存空间，成为主导菌，从而抑制病原菌的生长。

2.4 生防菌KD-16J在番茄果实伤口处生长动态的测定

生防菌KD-16J在番茄果实伤口处的生长动态见图9。

图9 生防菌KD-16J在番茄果实伤口处的生长动态Fig.9 Population dynamics of the strain KD-16J in wounds of tomato fruit

图9结果表明，拮抗酵母KD-16J可以较好地适应番茄果实伤口处的环境，培养初期生防菌KD-16J数量增殖较快，至第48小时生防菌KD-16J繁殖量达到最大值。此后，生防菌KD-16J数量基本维持在较高的浓度范围内，并始终高于初始测定值。

3 结论与讨论

酵母菌是人类应用最早的微生物，也是目前人们研究最为透彻的微生物[24]。酵母菌之所以能够成为化学杀菌剂的潜在替代品，除了其对多种植物病原菌如灰霉菌、青霉菌等具有拮抗作用外，它还具有定殖能力强，营养要求简单，干燥环境下也能存活，以及不会产生致敏性孢子和霉菌毒素等特点[25]。本试验将实验室分离筛选的一株生防菌KD-16J，通过形态学鉴定、生理生化试验以及ITS序列分析，鉴定为P.membranifaciens的一株。通过离体试验发现，生防菌KD-16J对灰葡萄孢菌菌落扩展、孢子萌发均存在明显的抑制作用，且随着酵母细胞浓度的增大，抑制效果也逐渐增强。显微镜观察发现，与生防菌KD-16J共培养的灰葡萄孢菌菌丝粗细不均，钝化现象明显，会出现内容物逐渐凝聚、空泡化现象。活体试验（番茄）表明生防菌KD-16J具有抑制番茄灰霉病、降低番茄发病率的作用，同时，喷洒生防菌KD-16J的时间越早，抑菌效果越好。番茄果实伤口处生长动态发现KD-16J能够很快在番茄表面定殖，这进一步表明和病原菌竞争营养与生存空间是该株酵母重要的拮抗机理。本试验不仅为P.membranifaciens防治番茄灰霉病提供一定的理论参考，也为生物防治技术应用于果蔬保鲜提供了依据。