基于网络药理学和分子对接的京制咳嗽痰喘丸治疗新冠肺炎机制研究

李佳霖 陆珊 范啸天 伍超 王郝嘉 刘莹莹 谭影影 张蓓 易剑平 姚璐 徐意 吴嘉瑞

摘要 目的：基于网络药理学和分子对接探讨京制咳嗽痰喘丸治疗新冠肺炎的潜在分子机制。方法：使用TCMATCOV V1.0数据库，获得京制咳嗽痰喘丸中的活性化合物和潜在治疗靶点;通过R语言软件进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析;利用Cytoscape 3.6.1软件构建化合物-靶点网络、重要化合物-靶点-通路网络;使用AutoDock软件进行活性成分和核心靶点的分子对接。结果：京制咳嗽痰喘丸的活性成分主要作用于TNF、IL-10、IL-6、IL-2、CCL2、CCL3、TLR7、LFNG等32个靶点，参与调节细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine Receptor Interaction）通路、T细胞受体信号通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）、IL-17信号通路（IL-17 Signaling Pathway）、C型凝集素受体信号通路（C-type Lectin Receptor Signaling Pathway）、JAK-STAT信号通路（JAK-STAT Signaling Pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-like Receptor Signaling Pathway）、Th17细胞分化（Th17 Cell Differentiation）、TNF信号通路（TNF Signaling Pathway）等多条可能与治疗COVID-19有关的信号通路。分子对接结果显示甘草次酸、薄荷烯酮均与关键靶点有较好的自发结合效果。结论：本研究通过网络药理学初步探究了京制咳嗽痰喘丸多成分、多靶点、多通路治疗新冠肺炎的作用机制。

关键词 京制咳嗽痰喘丸;新冠肺炎;网络药理学;分子对接;靶點;机制;R语言

Investigating on the Mechanism of Jingzhi Kesou Tanchuan Pills in the Treatment of COVID-19 by Network Pharmacology and Molecular Docking

LI Jialin1，LU Shan1，FAN Xiaotian1，WU Chao1，WHANG Haojia1，LIU Yingying1，TAN Yingying1，ZHANG Bei2，YI Jianping2，YAO Lu3，XU Yi3，WU Jiarui1

（1 School of Chinese Materia Medica，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 102488，China; 2 Beijing Zhongyan Tong Ren Tang Pharmaceutical R&d Co.Ltd，Beijing 100079，China; 3 Scientific Research Institute of Beijing Tongrentang Co.，Ltd，Beijing 100011，China）

Abstract Objective：To explore the potential molecular mechanism of Jingzhi Kesou Tanchuan Pills in the treatment of COVID-19 based on network pharmacology and molecular docking.Methods：We obtained the active compounds and potential targets in Jingzhi Kesou Tanchuan Pill by searching TCMATCOV V1.0 database.The enrichment analysis of GO and KEGG was performed by R language software.Cytoscape 3.6.1 software was used to construct the compound-target network and the essential compound-target-pathway network.AutoDock was applied to acquire the molecular docking result of active components and core targets.Results：The active compounds of Jingzhi Kesou Tanchuan Pills mainly acted on 32 targets，including TNF，IL-10，IL-6，IL-2，CCL2，CCL3，TLR7，LFNG，which involved in regulating Cytokine-cytokine receptor interaction pathway，T cell receptor signaling pathway，IL-17 signaling pathway，C-type lectin receptor signaling pathway，JAK-STAT signaling pathway，Toll-like receptor signaling pathway，Th17 cell differentiation，TNF signaling pathway and other signaling pathways that may be related to the treatment of COVID-19.The results of molecular docking revealed that glycyrrhetinic acid and piperitenone had better spontaneous binding effect with the key target.Conclusion：This study preliminarily explore the mechanism of multiple components，multiple targets，multiple pathways of Jingzhi Kesou Tanchuan Pills in the treatment of COVID-19 by network pharmacology.

Keywords Jingzhi Kesou Tanchuan Pills; Conronavirus disease 2019; Network pharmacology; Molecular docking; Targets; Mechanisms; R language

中图分类号：R285文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.23.013

新冠病毒（Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2，SARS-CoV-2）为β属冠状病毒，人群普遍易感，主要经呼吸道飞沫和密切接触传播。新冠肺炎（COVID-19）是一种由SARS-CoV-2感染引起的急性呼吸道传染病，目前还没有发现针对新冠肺炎的特异性治疗药物。目前，疫情在全世界给人们的生命安全造成了巨大威胁[1]。

中医与疫病抗争的历史至今已有上千年。关于“疫”的描述最早出现于《黄帝内经》中，“余闻五疫之至，皆相染易，无问大小，症状相似”，指出了疫病的传染性[2]。而关于“疫病”的病因、病机及辨证论治，历代医家均进行了深入的探索，形成了具有中医药特色的疫病防治体系[3]。在此次疫情的防控和医疗救治中，中医“未病先防，既病防变”的优势得到了充分的体现，与西医治疗配合使用，有效缩短了COVID-19患者的病程，降低患者的轻症转重症率与死亡率。在中医药介入治疗的患者中总有效率高达90%以上[4]。

京制咳嗽痰喘丸组方包括前胡、白前、炒杏仁、桑叶及麻黄等36味中药，主要功效是散风清热，宣肺止咳，祛痰定喘，适用于外感风邪，痰热阻肺，咳嗽痰盛，气促哮喘，不能躺卧，喉中作痒，胸膈满闷，老年痰喘等病症[5-6]。COVID-19重型及危重型患者多出现呼吸道症状，如气喘、胸闷、咳嗽等，在对其进行对症治疗的基础上还需要呼吸机支持。本研究采用网络药理学结合分子对接的方法对京制咳嗽痰喘丸治疗新冠肺炎的作用靶点和分子机制进行探索，希冀为进一步推进该药临床合理应用提供一定的理论基础[7]。

1 资料与方法

1.1 京制咳嗽丸核心靶点收集

在TCMATCOV V1.0（新冠肺炎药效网络分析平台，http：//tcmatcov.bbtcml.com/）平台采用多靶点药物对于疾病网络扰动作用的定量评价算法，进行中药复方及单味中药治疗COVID-19潜在药效的预测。通过比较药物作用前后疾病网络的网络拓扑特征变化，使用网络扰动率来评估中药复方及单味中药对于疾病网络的作用大小，从而对药物潜在有效性进行预测。首先，将京制咳嗽痰喘丸的方剂组成以拼音形式输入TCMATCOV V1.0平台，设置蛋白质相互作用置信分数为0.5，模拟京制咳嗽痰喘丸对COVID-19疾病网络的干扰。随后，对药物作用下的疾病网络稳健性进行分析，阴性对照选用半夏天麻白术汤，阳性对照选用清肺排毒汤。使用平均连接度（Average Degree）、最短路径平均长度（Average Shortest Path）、连接度中心性（Degree Centrality）和紧密度中心性（Closeness Centrality）衡量网络稳定性。同时用扰动总分评估药物对COVID-19疾病网络稳健性的干扰程度[8-10]。

1.2 潜在靶点基因富集分析

应用R 3.6.1软件中的Cluster Profiler包对潜在治疗靶点进行基因本体（GO）富集分析和京都基因和基因组百科全书（KEGG）富集分析[11]，通过生物信息学注释来评价潜在靶点的作用。本研究为筛选出显著富集的GO条目，将其阈值设定为P-value<0.05;KEGG富集分析阈值设置为P-value<0.05。

1.3 網络构建

1.3.1 化合物-靶点网络

根据TCMATCOV平台导出的京制咳嗽痰喘丸复方“中药成分-药物靶标-疾病蛋白”异质网络的网络数据文件，把京制咳嗽痰喘丸的活性成分和对应的靶点导入Cytoscape 3.7.2软件，构建化合物-靶点网络，并筛选度值较大的重要化合物和关键靶点。

1.3.2 药物-成分-靶点-通路网络

将重要化合物、关键靶点和重要通路导入Cytoscape 3.7.2软件，构建药物-成分-靶点-通路网络图[12-13]。

1.4 分子对接

从PubChem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载小分子化合物的结构，保存成SDF格式，通过Chem 3D软件将SDF格式文件转变为*mol2格式文件，导入Autodock Tools 1.5.6进行加氢，加电荷等处理。在RCSB PDB数据库（https：//www.rcsb.org/）中进行蛋白构象筛选，筛选条件应满足：蛋白结构生物来源是人类;蛋白结构通过X-晶体衍射得到;蛋白质晶体分辨率小于3 。对上述蛋白质进行去除水和小分子等处理，同时在Autodock Tools 1.5.6软件中进行加氢、加电荷、合并非极性氢等操作。使用Autodock Vina 1.1.2进行对接运算。根据结合自由能（Affinity（kcal/mol）把受体-配体对进行排序、筛选[14-15]。当结合能<0时则认为化合物与蛋白质二者之间可自发进行结合且产生相互作用，能量越低的分子构象越稳定。一般结合能≤-5.0 kcal/mol可认为结合效果良好。用PyMol 2.3.2软件进行可视化处理。

2 结果

2.1 京制咳嗽痰喘丸化合物-潜在靶点网络构建

化合物-靶点网络总共包括181个节点和373条边。见图1。绿色圆形节点代表化合物，红色圆形靶点代表潜在治疗靶点。京制咳嗽痰喘丸中存在一个化合物对应多个靶点现象，同时也存在不同化合物作用于相同靶点的现象，这体现了中药多成分、多靶点共同作用的特点。

2.2 京制咳嗽痰喘丸对COVID-19疾病网络扰动评价

网络平均连接度、连接度中心性和紧密度中心性这3个指标为负值，说明药物对于疾病网络的稳健性有破坏作用，它们越小，药物对疾病的网络干扰越大，治疗效果越明显。从表1中可以看出，京制咳嗽痰喘丸的连接度中心性和紧密度中心性均小于阳性对照，京制咳嗽痰喘丸对疾病网络的扰动率为15.91，虽总体作用不强于阳性对照药，但仍大于阴性对照药半夏天麻白术汤，可见其对重症COVID-19具有一定的治疗作用。

2.3 GO生物学过程分析

共获得1 641个条目。见表2。其中，生物学过程富集分析，得到1 605个条目，包括了对炎症反应的调节（Regulation of Inflammatory Response）、T细胞活化（T Cell Activation）等;细胞组分富集分析共得到9个条目，包括了吞噬小泡（Phagocytic Vesicle）、内吞小泡（Endocytic Vesicle）等;分子功能富集分析共得到27个条目，主要富集了细胞因子受体结合（Cytokine Receptor Binding）、细胞因子活性（Cytokine Activity）等。本研究选取各类分析P值较小的条目进行展示。见图2。X轴代表所占百分比，Y轴代表条目名称，气泡面积代表富集数量，气泡越大富集条目越多。

2.4 KEGG通路富集分析

依据P<0.05筛选32个潜在靶点的KEGG通路，共包含的通路有85条。见表3。经过查阅文献，其中可查到的与治疗新冠肺炎有关的重要通路有：细胞因子与细胞因子受体的相互作用（Cytokine-Cytokine Receptor Interaction）通路、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用（Viral Protein Interaction with Cytokine and Cytokine Receptor）通路、T细胞受体信号通路（T Cell Receptor Signaling Pathway）、百日咳（Pertussis）、IL-17信号通路（IL-17 Signaling Pathway）、C型凝集素受体信号通路（C-Type Lectin Receptor Signaling Pathway）、JAK-STAT信号通路（JAK-STAT Signaling Pathway）、趋化因子信号通路（Chemokine Signaling Pathway）、Toll样受体信号通路（Toll-Like Receptor Signaling Pathway）、Th17细胞分化（Th17 Cell Differentiation）、TNF信号通路（TNF Signaling Pathway）选取重要的通路进行展示。见图3。图中气泡越大，表示富集到此通路的基因越多。其中排序越靠前，提示其越可能是京制咳嗽痰喘丸治疗COVID-19的主要生物學功能及作用机制。

2.5 “药物-成分-靶点-通路”网络构建

京制咳嗽痰喘丸网络共包括20个节点，其中1个药物节点，2个化合物节点，8个靶点节点，9个通路节点。见图4。黄色三角形代表药物，红色圆形节点代表靶点，绿色正六边形代表化合物，粉色正方形代表信号通路。信号通路主要涉及炎症相关通路、免疫相关通路等。该图体现了京制咳嗽痰喘丸多成分、多靶点和多通路的复杂作用特点。

2.6 分子对接

选取重要化合物薄荷烯酮、甘草次酸、麻黄碱、伪麻黄碱等与筛选出来的核心靶标TNF、IL10、IL6、IL-2、CCL2、CCL3、TLR7、LFNG进行分子对接，同时由于血管紧张素转换酶Ⅱ（ACE2）、3CL水解酶（3CLpro）已作为抗COVID-19的潜在作用靶点被报道，故也选用这2个蛋白与重要化合物进行分子对接。对接结果见表4，所有对接结合能均小于0，表明京制咳嗽痰喘丸中的小分子可与核心靶点自发结合。用Pymol软件对对接结果进行可视化，红色框中表示小分子均对接在大分子蛋白内部，将红色部位进行放大可观察到详细的对接效果。见图5。

3 讨论

COVID-19属于中医“疫病”范畴，具有传染性强、易于流行，患者症状颇为相似等特点。中医药具有整体治疗，辨证施治、多靶点干预的独特优势，在救治患者时，重视肺与其他脏腑之间的联系，可做到祛邪而不伤正。COVID-19患者的病位主要在肺部，在轻型或普通型新冠肺炎患者中仅少数患者存在轻微的上呼吸道症状如鼻塞、流涕等，而在重症患者中气促则是非常常见的临床症状，危重型则多表现为呼吸困难，因此，在辨证选方的基础上需要针对性地选择合适的药物改善患者呼吸状况。研究表明京制咳嗽痰喘丸对于肺功能受损的呼吸道疾病具有较好的疗效。

通过对药物靶点活性成分预测发现甘草次酸、麻黄碱、伪麻黄碱、薄荷烯酮等化合物为度值靠前的活性成分。现代药理研究发现甘草次酸可减轻金黄色葡萄球菌引起的肺、肝组织的病理损伤[16]。甘草次酸（GA）的抗炎作用是选择性地抑制与花生四烯酸发生级联反应的磷脂酶A2和脂加氧酶的活性，减少前列腺素、白三烯等炎症介质，抑制前列腺素的合成与释放，发挥抗炎作用。麻黄的主要成分是麻黄碱和伪麻黄碱，麻黄碱能起到兴奋交感神经，松弛支气管平滑肌的作用，临床主要用于习惯性支气管哮喘的治疗。薄荷烯酮具有平喘、止咳、抗菌的作用。有研究表明，薄荷烯酮对组胺所致的豚鼠支气管痉挛可起到拮抗作用;可抑制电刺激豚鼠喉上神经所致咳嗽;对金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌、八联球菌等革兰阳性球菌和阴性球菌、杆菌等均有不同程度的抑制作用，临床可用于治疗慢性支气管炎[17]。

通过化合物-疾病靶点网络图发现京制咳嗽痰喘丸治疗新冠肺炎的靶点主要有TNF、IL10、CCL2、IL2、SOCS3、IL7、CXCL10、CCL3等，且大多数与炎症反应相关。其中，IL2、IL7、IL10为白细胞介素家族的靶点，白细胞介素和血细胞生长因子同属细胞因子，二者相互协调，相互作用，共同完成造血和免疫系统功能调节[18]。白细胞介素可参与激活与调节免疫细胞，介导T细胞和B细胞活化、增殖与分化，在炎症反应中起关键作用。CCL3可由多种细胞产生，具有诱导嗜碱性粒细胞、单核细胞等浸润的功能，有研究显示其可对哮喘等炎症性疾病的治疗发挥作用。

GO和KEGG富集分析表明，细胞因子-细胞因子受体的相互作用通路富集靶点最多，说明其可能是药物发挥治疗作用的重要通路。细胞因子是可溶性的细胞外蛋白或糖蛋白，可参与先天性以及适应性炎症宿主防御，细胞生长、分化、凋亡，血管生成以及恢复体内平衡发育和修复过程的细胞间调节剂[17]。白细胞介素-17（IL-17）家族在急性和慢性炎症反应中都起着至关重要的作用。IL-17A是新定义的T辅助细胞17（TH17）细胞子集的标志性细胞因子，在保护宿主免受细胞外病原体的侵害中起着重要作用，但在自身免疫性疾病中也可促进炎症病理，而IL-17F主要参与黏膜宿主防御机制。IL-17E（IL-25）是Th2免疫应答的放大器。IL-17C具有与IL-17A相似的生物学功能。IL-17家族通过其相应的受体发出信号，并激活包括核因子κB，MAPK和C/EBP在内的下游途径，以诱导抗菌肽，细胞因子和趋化因子的表达[19-20]。T细胞受体通路是与肺损伤保护相关通路有关的重要通路。T细胞受体（TCR）在T细胞的功能和免疫突触的形成中起关键作用。它提供了T细胞和抗原呈递细胞（APC）之间的连接。TCRs的激活促进了一系列信号级联，这些信号级联通过调节细胞因子的产生、细胞存活、增殖和分化最终决定细胞的命运。同时TCR信号的负调控可控制与该通路相关的免疫反应的过度激活，避免形成“细胞因子”风暴，防止新冠肺炎轻型和普通型患者向重型和危重型转化。

研究发现新冠病毒外膜上的刺突蛋白-S蛋白是病毒表面重要的标志蛋白，可以分为氨基端（N端）的S1亚单位和羧基端（C端）的S2亚单位，S1负责与细胞受体结合，S2插入病毒包膜，负责介导随后的膜融合。S蛋白与人体血管紧张素转化酶2（Angiotensin Converting Enzyme 2，ACE2）蛋白结合侵入人体。ACE2蛋白是一类跨膜的糖蛋白，在心脏、肾脏、睾丸、胃肠道等多个组织中都有表达。新冠病毒感染肺部时，导致肺部ACE2蛋白数量和功能降低，并引发急性肺衰竭，甚至休克[21-22]。3CL水解酶（Mpro）是冠状病毒的主要蛋白酶，在病毒复制过程中起关键作用[23-25]。因此选择ACE2蛋白和3CL Mpro作为分子对接的配体进行补充验证。分子对接结果表明，广藿香酮、薄荷烯酮与SARS-CoV-2 3CL水解酶、ACE2蛋白均有良好的结合力，提示京制咳嗽痰喘丸的关键活性成分可能通过干预病毒进入宿主细胞及病毒复制而发挥作用。

综上所述，本研究采用网络药理学分析了京制咳嗽痰喘丸的活性成分和潜在靶基因及作用通路，并运用分子对接技术进行验证。初步探索了京制咳嗽痰喘丸治疗COVID-19的物质基础、作用靶点及机制。综合分析表明京制咳嗽痰喘丸治疗COVID-19的分子机制可能是薄荷烯酮、甘草次酸、麻黄碱、伪麻黄碱等主要活性成分作用于TNF、IL10、IL6、IL-2、等關键靶点，通过TNF信号通路、T细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、IL-17信号通路等通路，发挥抑制“炎症因子风暴”、抗病毒等作用，以达到治疗COVID-19目的。

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（2020-12-19收稿 責任编辑：魏庆双，徐颖）