基于FTIR技术快速测定食用油中叔丁基对苯醌含量的研究

(叶 沁 卢文静 谌 迪 张 岑 肖朝耿 孟祥河

(浙江省农业科学院食品科学研究所1, 杭州 310021)

(浙江工业大学食品科学与工程学院2, 杭州 310014)

食用油在储藏、热加工过程中，受光照、高温作用，同时可能曝露于氧气、水分环境下，会发生水解、氧化、聚合、热裂解等一系列反应，并且油脂与其他食物成分的相互作用常常同时发生，造成食用油的质量、营养降低，甚至带来健康隐患[1]。叔丁基对苯二酚(TBHQ)，因其抗氧化效果好、成本低而被广泛应用于延缓油脂氧化[2]。然而由于食用油长期暴露在高温及有氧环境中，以及水分的存在会导致TBHQ自身发生氧化和降解。研究发现叔丁基对苯醌(TBBQ)是TBHQ氧化降解的主要产物[3]，且Li等[4]对比研究了大豆油在室温下储藏8 周以及120 ℃ 回流加热24 h 后TBHQ 损失及TBBQ 的生成情况。结果发现热处理过的食用油中TBBQ 的含量是非常小的(未给出具体数据)，其含量远小于室温下储藏的食用油(约10 μg/mL)。前期研究发现当含有(204.89±1.63) mg/kg TBHQ的不同种类食用油在不同煎炸条件下油炸薯条时，在第1 批次到第5 批次煎炸后，煎炸油和油炸薯条中TBBQ残留量均超过10 mg/kg[5]，表明不仅热处理食用油中存在TBBQ，含油食品中同样存在TBBQ风险。此外，有研究发现TBBQ的毒性明显高于TBHQ[6]，且可致多种模式细胞发生凋亡现象[7，8]。因此亟需对添加TBHQ的食用油及外加含TBHQ的食用油食品中的TBBQ含量进行监测分析。然而目前食用油中TBBQ的分析仍借鉴TBHQ的分析方法[3，4]，存在前处理复杂、耗时长等缺点，尚没有专用的检测分析方法，难以实现准确快速、实时在线监测。

红外光谱定量技术近年来发展迅速。因其分析快速、操作简单，可实现样品无损在线分析的特点，已广泛应用在食品品质监测领域[9,10]。此外，红外光谱技术通常结合化学计量学方法(如偏最小二乘法，PLS)组合使用，目前基于FTIR结合PLS法已构建了食用油中过氧化值[11]、碘价[12]、反式脂肪酸[13]、总极性化合物[14]和TBHQ[15]等快速检测模型，所建模型的线性相关系数范围为0.988 5～0.998 8，校正均方差为0.008 8～5.61，预测均方差为0.017～6.490。然而基于PLS法建模，需要大量的样本量，样品收集过程较为繁琐。此外，基于特征吸收的朗伯比尔定律定量也是光谱中常用的定量方法，操作简便，应用广泛。其前提是待分析组分有明显的特征吸收峰，且能够与其他吸收基线分离。近年来已有研究者利用红外光谱与朗伯比尔定律结合对食用油中的酸价[16]、磷脂含量[17]、微量水分[18]进行了快速测定，所建模型预测值与实际值的标准偏差在4.37%～8.21%范围内。然而关于红外光谱技术在测定食品中TBBQ含量的研究目前鲜有相关报道。

因此基于食用油及相关食品质量安全保障的需求，建立一个高效、快速、准确的TBBQ含量分析方法十分必要。本研究以大宗食用油代表精炼大豆油、菜籽油、葵花籽油和棕榈油等为研究对象，对比研究FTIR结合朗伯比尔定律法和FTIR-PLS法快速定量分析TBBQ含量，以期对食用油及相关产品的质量安全控制研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验试剂及样品

TBBQ(纯度≥98%)；色谱级乙腈、色谱级正己烷。葵花籽油、大豆油、菜籽油、调和油：市售，棕榈油杭州市粮油检测中心。

1.2 实验仪器与设备

配有透射附件的Bruker Tensor 27傅里叶中红外光谱仪(OPUS光谱分析软件)，7890气相色谱仪。

1.3 实验方法

1.3.1 TBBQ的GC法分析

食用油中TBBQ的测定方法参照美国分析化学协会TBHQ标准分析方法(AOAC Official method 983.15)。具体方法为：取2 g油至50 mL离心管中，加入10 mL乙腈饱和的正己烷溶液，反复摇匀后转移至125 mL分液漏斗中，加入10 mL正己烷饱和的乙腈溶液中，剧烈振荡，静置至分层。收集下层至50 mL圆底烧瓶中。重复萃取2次，收集萃取液，旋蒸至近干，定容至10 mL，过0.45 μm膜，进行气相分析。

GC条件：色谱柱HP-5 (30 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始柱温60 ℃，保持2 min，随后以10 ℃/min升至250 ℃。氮气流速1.5 mL/min，进样口温度280 ℃，进样量1 μL，不分流。

1.3.2 红外光谱(FTIR)法

1.3.2.1 样品的准备

标准集样品制备：准确称取TBBQ(≥98%)标准品0.100 0 g于100 mL容量瓶中，色谱级乙腈溶解并定容，配制成1 000 μg/mL TBBQ-乙腈标准储备液避光保存于4 ℃条件下。分别移取储备液并稀释至TBBQ的质量浓度分别为2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL。精确配制成总体积为5 mL的混合溶液，摇匀，静置后备用。

预测集样品制备：将TBBQ标准品分别按比例随机溶于精炼葵花籽油、大豆油、花生油和菜籽油中，配置方法和比例同上。取2 g油样用正己烷饱和的乙腈溶液萃取后，精确定容至5 mL得到的TBBQ乙腈溶液。

实际煎炸油样品制备：取1.5 kg添加200 mg/kg TBHQ的大豆精炼油、菜籽油或棕榈油置于恒温煎炸锅中，185 ℃下煎炸60 g预解冻的薯条，每批次煎炸3 min，每隔1 h煎炸1批，连续煎炸24批，以获得不同TBBQ含量的不同种类的煎炸油。每批次煎炸结束后，取10 mL煎炸油冷却至室温，装入棕色玻璃样品瓶中于-80 ℃储存用于后续TBBQ含量测定。TBBQ萃取方法同前述。

1.3.2.2 红外光谱的采集

透射样品的采集，CaF2样品池用色谱纯正己烷润洗5遍后，用待测样品润洗3 遍，对TBBQ乙腈萃取液或样品油上样，采集FTIR光谱，每样重复采集3次，以平均光谱记录。OPUS软件记录4 000～400 cm-1的吸收光谱，分辨率为4 cm-1，扫描次数为32次，测量环境的湿度需小于70%，温度保持在25 ℃。

1.3.2.3 模型建立

朗伯比尔定律法：分别取光谱级乙腈溶剂，采用 1 055 μm CaF2样品池，记录溶剂波谱S0，同时分别取质量浓度为2、5、10、25、50、75、100、200 μg/mL TBBQ乙腈溶液，记录标准样品的原始波谱S1系列。在模型优化过程中，做波谱减法运算即S1-S0，得到系列差谱S2。同时对波谱S1和差谱S2进行二阶求导，并放大1 000倍，分别得到标准波谱的二阶导数图谱S1-2nd和差谱的二阶导数图谱S2-2nd。分别测量原始波谱S1、差谱S2、原始二阶波谱S1-2nd和差谱二阶S2-2nd相应特征峰吸收强度，将其与TBBQ浓度相关，得到乙腈中TBBQ浓度的标准曲线。

PLS法：采用TQ Analyst光谱分析软件对所得红外光谱进行二阶导数，自动平滑等预处理及分析，优化模型。在光谱采集过程中，光谱噪声会造成偏最小二乘法出现微小偏差，影响模型的稳定性。本实验采集的光谱自动平滑以提高模型的稳定性，然后采用PLS模块建模分析。

1.3.2.4 模型稳定性的验证

对于所建的TBBQ朗伯比尔定律模型，随机抽取煎炸后含有TBBQ的煎炸油，对比FTIR法TBBQ预测值与GC法标准值，计算相对误差。

对于所建的TBBQ-PLS模型，需要对其稳定性进行验证。将TBBQ随机溶于大豆油、菜籽油和花生油，掺入比例随机配制预测集样品。计算相关系数(R2)，交叉验证误差均方根(RMSECV)、验证均方差(RMSEC)、预测均方差(RMSEP)。

外部验证独立样品分别为煎炸薯条不同时间后所得的大豆油、葵花籽油、棕榈油、花生油，以及随机选取的市售各类食用油。

1.4 数据处理

利用TQ Analyst光谱分析软件进行定标模型的建立，建立导入的预测样品根据建立的模型进行数学运算从而得出预测样品的TBBQ的浓度，同时利用Origin 8.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 FTIR结合朗伯比尔定律快速分析TBBQ含量

2.1.1 红外光谱的分析

图1 典型的TBBQ乙腈溶液红外光谱图

根据TBBQ的结构式，分别基于3 009、2 945、1 656 cm-1处进行朗伯比尔定律线性拟合，其所得的回归方程和相关系数如表1所示。结果显示，基于1 656 cm-1处所得的标准曲线效果最优，线性相关系数为0.977 9，故后续朗伯比尔建模波数采用1 656 cm-1。

表1 基于不同波数的标准曲线

2.1.2 基于不同波谱处理的TBBQ标准曲线的建立

由于样品本身的物理性质、环境因素、仪器噪声等因素会影响红外光谱的采集，引起基线漂移和光谱重现性较差等问题，因此需要通过对波谱进行预处理来提高模型的准确度[20]。有研究表明，二阶导数可有效降低波谱在采集过程中出现的漂移[10]，而差谱则可扣除溶剂基质吸收影响[18]。本实验将对原始波谱分别进行差谱和差谱二阶导数处理，TBBQ-乙腈溶液、差谱及差谱二阶导数的波谱在1 640～1 660 cm-1波段内的局部放大图如图2所示，构建的线性回归方程相关结果列于表2。基于差谱所构建的回归方程的线性效果(R2=0.994 9)均明显优于原始波谱(R2=0.977 9)，这可能是因为乙腈中微量水分(吸收峰1 630 cm-1)存在对TBBQ的特征吸收峰造成了一定的干扰。基于二阶导数图谱的回归方程的线性关系(R2=0.998 1)优于差谱(R2=0.994 9)，这可能是因为二阶导数可使峰锐化，利于峰拆分，此外还可部分消除基质吸收，因此表现出较高的分析精密度。二者均明显优于TBBQ乙腈溶液原始红外波谱回归方程。最佳标准曲线为TBBQ(μg/mL)=108 9.5Abs-11.35。

表2 基于不同波谱处理的标准曲线

图2 TBBQ-乙腈溶液(0～200 μg/mL)原始FTIR波谱、差谱及差谱二阶导数波谱局部放大图(1 640～1 660 cm-1)

2.2 TBBQ-朗伯比尔定律模型稳定性分析

基于不同波谱处理方法所得红外光谱TBBQ特征峰的标准曲线稳定性分析结果如表3所示。不同波谱处理方法的所得TBBQ红外预测值与化学值之间的相对误差在1.22%～14.79%之间。从相对误差的平均值看，基于差谱所构建的模型稳定性均略优于原始波谱所构建模型的稳定性；且经差谱-二阶导数预处理组模型稳定性最佳，相对误差范围为1.22%～6.55%，相对误差平均值仅为3.46%。杨志成等[18]采用溶剂萃取耦合FTIR技术结合朗伯比尔定律法分析了食用油中微量水分，同样发现二阶导数处理可以明显改善模型的准确度。模型预测准确度后面将采用独立实际煎炸油样品和实际食用油样品进行外部验证，并结合PLS模型一起讨论。

表3 基于不同波谱处理方法测定的TBBQ标准值与红外预测值比较

2.3 基于FTIR结合PLS快速分析TBBQ含量

表4 基于中红外透射光谱结合PLS在不同预处理方式及不同建模区间对TBBQ模型稳定性的影响

10组不同TBBQ浓度的精炼葵花籽油、大豆油、花生油、菜籽油样品，采用原波谱最佳模型的预测结果与真实值的线性相关方程为Y=0.973 7X+0.005，相关系数R2=0.987 2，数据显示FTIR-PLS模型TBBQ预测结果均与实际值高度符合，说明所构建的预测模型对TBBQ含量预测值和添加值一致性较好。Ammawath 等[15]基于TR-FTIR技术结合PLS法，在3 600～2 800 cm-1区间上构建了精炼棕榈油中TBHQ含量的快速检测模型。结果显示其模型的相关系数R2为0.996 1，模型校正均方差为5.06，预测均方差为6.49。然而该模型并不适用于油脂中TBBQ的含量检测。Li等[21]采用液相色谱技术构建了食用油中TBBQ含量的检测方法，所建方法的回收率为96.28%～100.58%，相对标准偏差仅为0.30%～1.71%，该方法准确度较高。然而传统化学法分析时间较长，难以实现快速、实时在线监测。

2.4 准确性实验

随机选取15组不同温度下煎炸薯条1～24 h后的实际煎炸油样品，分别采用标准GC法、朗伯比尔定律模型和PLS模型进行TBBQ含量测定，不同模型预测数据列于表5。其中朗伯比尔定律模型预测组的平均相对误差4.89%；PLS预测组为8.53%。对比发现本研究所采用的FTIR结合朗伯比尔定律和FTIR结合PLS法所构建的TBBQ快速检测模型均可用于煎炸油中TBBQ含量的快速测定，并且FTIR结合朗伯比尔定律法的准确性优于PLS法。

表5 准确性验证结果

为了进一步验证模型的稳定性和准确性，本实验收集了市售的10种不同品牌不同类型的食用油作为外部验证的样品，分别用标准GC法、朗伯比尔定律模型和PLS模型进行TBBQ含量测定，不同模型预测数据列于表6。市售的10种食用油中TBBQ含量朗伯比尔定律模型和PLS模型预测组的平均相对误差分别为6.80%和8.40%，表明本研究所构建的TBBQ快速检测模型具有良好的预测能力，模型稳定性和准确度较好。因此本实验所构建的FTIR快速分析煎炸油中TBBQ的方法可有望实现替代传统化学分析法。

表6 基于不同模型预测10种市售食用油TBBQ含量

3 结论

建立了基于FTIR技术的食用油TBBQ快速测定方法，分析时间从传统GC方法的2～3 h缩短到30 min。经分析比较发现，FTIR结合朗伯比尔定律法和FTIR结合PLS法均可用于食用油中TBBQ含量的快速测定。其中，FTIR结合朗伯比尔定律法所构建的模型稳定性和准确度明显更好，该方法具有简便、快速、准确、经济等优点，适合于食用油品质的快速分析，这为逐步构建食用油在煎炸过程中的质量控制标准提供参考，同时对改善煎炸油及煎炸食品质量安全，保证消费者身体健康具有积极意义。