一种直接用于碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌引起尿路感染的主动筛查研究

刘景武 王亚倩 王超 种克 张蕊

【摘 要】目的：建立一種简便的可直接用于临床尿液标本中，由碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌引起尿路感染的主动筛查方法，并对耐药基因进行分型。方法：使用建立的方法对人工模拟的样本进行检测，确定其检测灵敏度。对临床样本采用培养结合PCR的方法和免疫层析方法分别进行检测，以培养结合PCR的方法作为金标准，评价免疫层析方法作为直接检测临床尿液标本中碳青霉烯耐药肠杆菌耐药基因快速分型的性能。结果：采用免疫层析方法检测人工模拟样本中的KPC酶和NDM酶，其中携带KPC酶的肺炎克雷伯氏菌检测灵敏度为1×104CFU/ml， 携带NDM酶的大肠埃希氏菌检测灵敏度为1×104CFU/ml。检测了100份临床尿液标本，与培养结合PCR方法相比较，采用免疫层析法直接检测临床尿液标本灵敏度为100%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为100%，Youden，s指数为1。结论：采用离心结合免疫层析方法，可直接用于尿标本中碳青霉烯耐药基因的筛查和基因类型。

【关键词】碳青霉烯酶，分型，PCR，免疫层析

A simple and convenient method for active screening of urinary tract infection caused by carbapenem-resistant enterobacteriaceae bacteria

Liu Jingwu1， Wang Yaqian1， Wang Chao2， Zhong Ke3， Zhang rui1 1.Department of clinical laboratory， the third hospital of shijiazhuang， Hebei Shijiazhuang 050001， China；2. Department of Laboratory Medicine， Shijiazhuang People’s Hospital， Hebei Shijiazhuang 050001， China；3.Shijiazhuang Vocational College of Technology Information ， Hebei Shijiazhuang 050001， China

【Abstract】Objective：To establish a simple and direct screening method for urinary tract infection caused by carbapenemse-resistant enterobacteriaceae in clinical urine specimens， and to type the drug-resistant genes. Methods：The established method was used to detect the artificial simulated samples and determine their detection sensitivity. The culture-bound PCR method and the immunochromatography method were used to detect the clinical samples respectively.The culture-bound PCR method was used as the gold standard.The analysis software was used to analyze the detection results of the immunochromatography and evaluate its performance as a direct method to detect the rapid typing of carbapenemse-resistant enterobacteriaceae. Results：KPC enzyme and NDM enzyme in artificial simulated samples were detected by immunochromatography. Klebsiella pneumoniae carrying KPC enzyme was detected at a sensitivity of 1×104CFU/ mL， and Escherichia coli carrying NDM enzyme was detected at a sensitivity of 1×104CFU/ mL. 100 clinical urine specimens were tested， compared with the culture combined with PCR method，the sensitivity and specificity of immunochromatography were 100%， positive predictive value was 100%， negative predictive value was 100%， and Youden， S index was 1.Conclusion： The centrifugation combined with immunochromatography can be directly used to screen clinical urine samples for the presence of enterobacteriaceae bacteria carrying carbapenem resistance genes as well as the types of drug-resistant genes.

【Key？Words】Carbapenemase； Typing；PCR； Immunochromatography

由耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（CRE）造成的感染呈现逐年上升的趋势。目前的检测方法，不能很好地满足临床快速筛查的需求。免疫层析方法具有操作简便，检测速度快等特点，本研究采用免疫层析方法产品通过建立一套简单的前处理方法直接用于临床尿液标本中碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌耐药基因判断，并评价其应用价值[1-2]。

1.1 菌株来源

菌株分离自我院住院病人标本。

1.2 仪器及试剂

DL-96全自动细菌测定仪、上海宏石荧光定量扩增仪、 NG-Test CARBA5碳青霉烯酶检测试剂盒。

2.1 人工模拟样本的检测。

2.1.1 将携带碳青霉烯酶的肺炎克雷伯氏菌接种到营养肉汤培养基中，37℃培养18h～24h，取10ml培养液，3500×g离心10min，菌体沉淀用无菌生理盐水悬浮定量到10ml。取1ml菌悬液加入9ml无菌生理盐水中进行10倍连续稀释，取0.1ml稀释液采用混菌法进行培养计数。其余菌悬液4℃冰箱冷藏。

2.1.2 取经计数的菌悬液定量稀释至菌液终浓度为1×103CFU/ml～1×107CFU/ml。

2.1.3 免疫层析法检测碳青霉烯酶：（1）取人工污染的标本10ml，3500×g离心力，离心10 min，弃去上清液，沉淀物中滴加250μl的提取缓冲液，在漩涡振荡器上震荡混匀数秒，静置待用。（2）测试：使用一次性吸管吸取5滴约100μl制备好的液体加到检测卡的样本区，15分钟后读取结果。

2.2 实际样本的检测

选取2018年6月至2018年12月之间住院和门诊患者标本。其中住院患者尿液标本80例，门诊患者尿液标本20例，男性50例，女性50例，年龄40岁～80岁，平均年龄（45.35±12.39）岁如果未分离到碳青霉烯耐药的肠杆菌科细菌继续增大样本量到150例。嘱咐患者留取2份清洁中段尿标本于无菌容器中，每份10 ml，一份用于免疫层析法直接检测碳青霉烯酶，一份用于培养。

2.2.1 免疫层析法检测碳青霉烯酶，按照2.1.3操作步骤进行检测。

2.2.2 碳青霉烯酶基因扩增及测序，取一份标本按照尿液标本微生物培养程序进行培养，阳性标本进行微生物鉴定和药敏试验。药敏试验结果为碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌，采用PCR方法进行碳青霉烯酶基因扩增和分型。实验所得产物进行测序，测序结果与已知序列比对，最终确定菌株基因型。

2.3 统计学分析

以PCR方法作为判断碳青霉烯耐药肠杆菌产酶基因的金标准，对免疫层析方法进行性能评价。

3.1 免疫层析

采用免疫层析方法检测人工模拟样本中的KPC酶和NDM酶，其中携带KPC酶的肺炎克雷伯氏菌检测灵敏度为1×104CFU/ml， 携带NDM酶的大肠埃希氏菌检测灵敏度为1×104CFU/m。

3.2 实际样本的检测 共检测了100份临床尿液标本，见表1。

3.3 统计学分析

以培养结合PCR方法作為碳青霉烯耐药基因的检测金标准，评价免疫层析法直接检测碳青霉烯耐药基因的能力，结果如下：采用免疫层析法直接检测临床尿液标本灵敏度为100%，特异性为100%，阳性预测值为100%，阴性预测值为100%，Youden，s指数为1。

研究表明主动筛查 CRE 并施行严格的干预措施可以取得显著的成效，目前，常用的碳青霉烯酶检测、分型方法主要有表型检测法和分子检测技术，如Carba NP 试验、PCR方法等，都不能很好地满足临床快速筛查的需求。本研究采用免疫层析试剂NG-TestCARBA5，作为筛查方法，结合离心的前处理方法，能够直接用于碳青霉烯耐药基因的检测和分型，操作简便，检测时间短，1小时内就能完成检测[3-4]。本研究对临床100份尿液标本进行了检测，受标本所限，检测到的携带有碳青霉烯药物耐药基因的样本数较少，检测到的耐药基因主要集中在KPC和NDM两种耐药基因上，缺少其他耐药基因的菌株，分析其原因，可能与本地区的流行株有关，在今后的工作中继续收集菌株，完善其他耐药基因检测数据。

参考文献

[1] ZERR D M，WEISSMAN S J，ZHOU C，et al.The Molecular and Clinical Epidemiology of Extended-Spectrum Cephalosporin- and Carbapenem-Resistant Enterobacteriaceae at 4 US Pediatric Hospitals[J]. Journal of the Pediatric Infectious Diseases Society，2017，6（4）：366-375.

[2] ASAI N，SAKANASHI D，SUEMASTU H，et al.The epidemiology and risk factor of carbapenemresistant enterobacteriaceae colonization and infections： Case control study in a single institute in Japan[J].Journal of infection and chemotherapy：official journal of the Japan Society of Chemotherapy，2018，24（7）：505-509.

[3] 俞凤，胡龙华，蒋沁炆.耐碳青霉烯类抗生素大肠埃希菌的耐药基因检测及传播机制探讨[J].山东医药，2018，58（47）：36-39.

[4] 苏晓曼，张义，李慧玲.碳青霉烯酶在主动筛查CRKP 耐药机制中的作用[J].黑龙江医药科学，2019，42（3）：52-53.

基金项目：2017年石家庄市科技局科技支撑计划项目《耐碳青霉烯类药物肠杆菌科细菌耐药机制及毒力研究》（171461543）。