CRISPR/Cas系统在抗菌治疗领域的研究进展

曾珍，胡莹

·综述·

CRISPR/Cas系统在抗菌治疗领域的研究进展

曾珍，胡莹

650101 昆明医科大学第二附属医院检验科

抗生素能够有效控制细菌感染，但随着抗生素的滥用与细菌适应，细菌耐药性问题日益严重，已对全球公共卫生与环境安全构成重大威胁[1]。削弱细菌的耐药性，防止出现多重耐药以及耐药性传播已经成为急需解决的问题。此外，传统的抗生素一般都是广谱类抗生素，在对致病菌进行灭杀时也会对其他有益菌造成一定的损害，长期使用可能会导致菌群失调并加剧细菌耐药[2]。

细菌在面对外源遗传物质（如噬菌体和质粒）的入侵时，会形成一个抵御这些外源遗传物质的免疫防御系统，即成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及关联基因（CRISPR associated，Cas）组成的 CRISPR/Cas 系统[3-4]。CRISPR/Cas 系统于 1987 年由 Ishino 等[5]在大肠埃希菌中首次发现。之后的研究表明，CRISPR/Cas 系统还分布于 40% 已测序细菌和 90% 已测序古细菌的基因组中[6-7]。目前，CRISPR/Cas 系统已经被开发成为一种新型的抗菌剂，它能通过靶向破坏目标基因（如抗生素耐药基因或毒力基因），使细菌恢复对抗生素的敏感甚至直接致其死亡，同时限制有害基因在微生物间的转移和流行。此外，有研究已经证实，利用 CRISPR/Cas 系统可以从混合菌群中选择性地杀伤某种特定细菌，而不会对周围其他菌株产生影响，从而为“微生物组编辑”的探索应用开辟了一种新的思路和方法。

1 CRISPR/Cas 系统结构及作用机制

近年来，CRISPR/Cas 系统发展迅猛，除了基因编辑领域，在生物医学及药物开发等不同领域中也逐步得到应用[8]。目前，CRISPR/Cas 系统根据 Cas 蛋白作用机制的不同，被划分为 Type I、Type II 和 Type III 等 3 种不同的类型[9]，并且还可以进一步细分。其中，Type II 型 CRISPR/Cas 系统（CRISPR/Cas9 系统）具有结构简单、操作方便、特异性高等特点，是研究最为深入且应用最成熟的一种类别。Type II 型 CRISPR/Cas 系统的位点结构如图 1 所示，主要由 CRISPR 序列、上游的前导序列（Leader）和 Cas 基因三部分构成。其中，CRISPR 序列由多个短而高度保守的重复序列（21 ~ 48 bp）和多个长度相似的间隔序列（26 ~72 bp）组成。在重复序列中含有长度为 5 ~ 7 bp 的回文序列，可以形成发卡结构，它是识别靶标基因的关键元件。间隔序列则是被细菌俘获的外源 DNA 序列。CRISPR/Cas 系统发挥作用的关键之一就是能够对再次入侵细菌的这些外源遗传物质予以精确打击。前导序列位于 CRISPR 位点的上游，长约 550 bp，它被认为是 CRISPR 序列的启动子。上游的 Cas 基因是一个多态性的家族基因，包括有 Cas 1 ~ 10 等多种类型，它是 CRISPR 免疫防御途径中的基本组成成分。此外，Cas 基因编码的 Cas 蛋白都可以和 CRISPR 序列区域共同发生作用。Cas 基因与 CRISPR 序列共同进化，最终在细菌中形成了高度保守的 CRISPR/Cas 系统[10]。

图 1 CRISPR/Cas9 系统的位点结构图

在 CRISPR/Cas 系统中，CRISPR 序列通过与 Cas 蛋白进行配合来防御外源遗传物质的入侵，其作用机制可以分为三步。①外源 DNA 的俘获。当病毒入侵时，CRISPR/Cas 系统需要俘获一段外源 DNA 序列，然后找到其原间隔序列邻近基序（protospacer adjacent motif，PAM），并将邻近 PAM 的 DNA 序列作为候选的原间隔序列。接着，在 Cas1/2 蛋白复合物以及其他酶的协助下，CRISPR/Cas 系统会从这段外源 DNA 序列中将原间隔序列剪切下来，插入到基因组 CRISPR 位点的 5' 端，从而将其作为新的间隔序列整合到基因组的 CRISPR 序列之中。②crRNA（CRISPR RNAs）的合成。在前导区的调控下，CRISPR/Cas 系统会在病毒入侵时转录出前体 crRNA（pre-CRISPR-derived RNA，pre-crRNA）和反式激活 crRNA（trans-acting crRNA，tracrRNA）两种类型的 RNA。tracrRNA 的主要功能是作为连接 crRNA 和 Cas 蛋白的桥梁。接着，根据入侵者的类型同时在核糖核酸酶 III 的协助下，pre-crRNA、tracrRNA 以及 Cas9 编码的 Cas 蛋白组成的复合体会选取对应的间隔序列 RNA 并对其进行剪切，crRNA 因此得以形成。为了下一步的剪切，crRNA、Cas9 蛋白以及 tracrRNA 会进一步组合，形成最终的复合物。③靶向干扰。在病毒的二次感染中，为了能识别出与 crRNA 互补的原间隔序列，crRNA、Cas9 以及 tracrRNA 组成的复合物会对整个外源DNA 序列进行扫描，同时定位到 PAM/原间隔序列的区域。此时，外源 DNA 的双链将被解开，互补链会与合成的 crRNA 进行杂交，同时另一条链保持游离状态。随后，Cas9 蛋白发挥作用，与 crRNA 互补的 DNA 链以及非互补的 DNA 链被剪切。最终，Cas9 使 DNA 双链断裂，沉默外源 DNA 的表达，入侵者也因此被消灭。

作为一种强大的基因编辑技术，CRISPR/Cas 系统可以定点且精确地对目标基因进行编辑。随着对 CRISPR/Cas 系统的进一步研究，CRISPR/Cas 系统已经被广泛应用于基因敲除、基因替换、基因激活、疾病模型构建，甚至是基因治疗等领域。

2 CRISPR/Cas 在抗菌治疗中的应用

2.1 CRISPR/Cas 的抗耐药菌应用

随着抗生素的滥用以及细菌适应，细菌多重耐药以及耐药性传播等问题不断出现，采取必要的措施削弱细菌的耐药性已刻不容缓[11]。针对这一现象，一些新型的非抗生素疗法在针对耐药菌感染方面的优异表现开始得到研究人员的关注。CRISPR/Cas 系统可以通过设计靶向耐药相关基因或耐药细菌的基因组 gRNA（guide RNA），然后对耐药细菌特有靶向序列进行切割，使耐药细菌对抗生素的敏感得以恢复甚至直接致其死亡，在基因水平上为防治细菌多重耐药的研究提供了新的方向[12]。CRISPR/Cas 系统抗耐药菌的基本原理是利用噬菌体将 CRISPR/Cas 系统相关基因传递到耐药菌内，当靶向耐药基因位于耐药性质粒上时，CRISPR/Cas系统对靶向耐药基因的切割会导致耐药性质粒的丢失，耐药菌对抗生素的敏感性能够被恢复。当靶向耐药基因位于耐药细菌的基因组上时，CRISPR/Cas 系统切割靶向耐药基因会导致 DNA 双链断裂，从而使得耐药菌死亡[13]。此外，如果 CRISPR/Cas 系统能够在耐药菌中稳定存在并且遗传下来，当含有相同靶向耐药基因的 DNA 片段再次入侵耐药菌时，CRISPR/Cas 系统能够对其进行防御，并且可以抑制耐药基因的传播[14]。

通过 CRISPR/Cas 系统沉默耐药细菌的耐药相关基因，可以达到抑制细菌耐药性的目的。Kim 等[15]为了恢复产超广谱 β-内酰胺酶（extended-spectrum beta-lactamase，ESBL）大肠杆菌对抗生素的敏感性，利用 CRISPR/Cas9 系统靶向超广谱耐 β-内酰胺类抗生素的大肠杆菌中的抗生素抗性基因，成功清除了产 ESBL 大肠杆菌内的抗生素耐药性质粒。因此，这种对耐药性抗生素的重新敏化（ReSAFR）技术可对携带抗生素耐药性质粒的多药耐药性（MDR）细菌进行治疗。Citorik 等[16]和 Bikard 等[17]分别以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌菌体内本身所含的抗生素耐药性质粒为靶标，同时利用噬菌粒为载体来传递 CRISPR/Cas9 系统。最终，细菌中的抗生素耐药性质粒被成功清除，耐药菌对抗生素的敏感性也得到恢复。Chen 和 Novick[18]利用噬菌粒介导的 CRISPR/Cas9 系统有效去除了金黄色葡萄球菌中携带抗生素抗性基因的耐药性质粒，从而使金黄色葡萄球菌对抗生素重新敏感化。

细菌针对抗生素不断出现的耐药性给临床治疗带来了巨大的挑战，对 CRISPR/Cas 系统的研究为人们解决这一问题迎来了转机[19]。此外，CRISPR 系统的结构和功能与细菌的耐药性密切相关，对两者之间的关系进行深入分析将有助于更好地理解细菌的耐药机制，进而为防治细菌耐药提供新的方向。

2.2 CRISPR/Cas选择性靶向细菌群体

通过对细菌生长过程中一些保守的代谢途径进行抑制或破坏，广谱类抗生素往往能达到不错的杀菌或抑菌效果，但广谱类抗生素在杀菌过程中无法有效区分杀菌对象，除了灭杀致病菌也会损害有益菌。长期使用广谱类抗生素也会产生一些问题，如导致环境与人体肠道内的菌群失调、细菌耐药性的不断累积与传播等。因此，为了维持正常的微生物菌群，能够在特异性地杀伤某种病原菌时不会对环境中的其他微生物造成不利影响显得尤为重要。CRISPR/Cas 系统的出现，使得人们可以设计具有特定杀菌作用的CRISPR 抗菌剂。

2014 年，Gomaa 等[20]的研究表明，使用 CRISPR/Cas 系统进行基因组靶向可用于个别细菌菌株和物种的序列特异性和可滴定去除。此外，还以大肠杆菌中的 I-E 型 CRISPR/Cas 系统作为模型，证明了 CRISPR/Cas 系统的自我靶向作用，同时成功清除了混合菌株中某一特定的菌株并且使所有其他邻近的菌株不受影响。为了对细菌杀伤的特异性进行控制，该研究采用了靶向某个细菌独有序列的方式，从而为人们实现选择性地杀伤混合菌群中某种特定细菌奠定了坚实的理论和实验基础。Bikard 等[17]利用含有CRISPR/Cas 系统的噬菌体侵染金黄色酿脓葡萄球菌后，通过靶向毒力基因，成功杀死了有毒的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）。此外，在小鼠皮肤感染的实验中，CRISPR/Cas 抗菌素也能够有效减少小鼠皮肤定植模型中的金黄色葡萄球菌的数量。Citorik 等[16]以噬菌体作为运送载体，将完整的外源性 CRISPR/Cas 系统传递到大肠杆菌之中，通过靶向 β-内酰胺酶 1（NDM-1）基因和含一个突变的 gyrA 基因，选择性杀死了表达特定靶基因的耐喹诺酮大肠杆菌。

此外，有研究报道可以应用 CRISPR/Cas 技术来研发序列特异性的抗生素，这些抗生素发挥作用的关键是使用单链向导RNA(single-guide RNA，sgRNA)引导 Cas9 核酸内切酶选择性靶向病原体特定的 DNA 序列[16-17]。与常规的抗生素相比，在选择好特定的靶基因后，CRISPR/Cas 抗菌剂可以用于与靶基因相匹配的 sgRNA 进行编程。因此，在选择性地杀死含有特定靶基因的细菌时，CRISPR/Cas 抗菌剂能够使周围其他的细菌不受影响。因此，CRISPR/Cas 系统为研究者们创造了以序列特异性方式操纵复杂细菌种群的机会。

3 CRISPR/Cas 系统的问题及应对措施

由于具有对病原菌序列高效且特异性清除的优点，CRISPR/Cas 抗菌药具有不错的效果和特异性，能够成为一种有潜力替代传统抗生素的新型抗菌武器。但是，将 CRISPR/Cas 系统应用于抗菌治疗仍然存在一些问题有待解决。

首先，使用 CRISPR/Cas 系统作为杀菌药物，需要找到一种安全有效的递送途径将 CRISPR/Cas 系统运输到细菌细胞内。噬菌体天然靶向细菌的优势能够有效地将 CRISPR/Cas 系统相关基因运输到细菌中。但是，利用噬菌体作为 CRISPR/Cas 系统运载工具也存在和噬菌体疗法相同的缺点，如噬菌体侵染的专一性会导致其应用范围过窄[21]，细菌在面对噬菌体入侵时产生的细胞免疫反应会导致噬菌体入侵的效率降低，噬菌体裂解病原菌造成的内毒素释放，以及噬菌体在应用到临床上时需要考虑的安全性问题。针对上述问题，可以采取一些方法解决，一种方法是改造噬菌体让其能够适应更多的宿主[22]，另一种方法是使用鸡尾酒疗法，即将多种噬菌体混合在一起然后对菌群进行侵染[23]。此外，还有研究者提出了将细胞外囊泡作为 CRISPR/Cas 系统的运载工具[24]、采用质粒接合的方式运输 CRISPR/Cas 系统等不同方法，不过这些方法在有效性和安全性方面尚有不足，效率也比较低。总之，现有的各种 CRISPR/Cas 系统递送方法仍有较多的局限和不足，需要不断进行改进和优化，同时还应继续研究新的递送方法。

其次，CRISPR/Cas 系统存在一定的脱靶效应[25]。CRISPR/Cas 系统的特异性取决于 sgRNA 上的识别序列，脱靶效应就是CRISPR/Cas 系统设计的某个位点的 sgRNA可能会识别其他位点，从而造成在切开靶点位置的同时存在切开其他位点的可能性。为了尽可能避免脱靶效应，需要将 CRISPR 相关蛋白 Cas9 引导至其基因组中精确靶标的 sgRNA。当 Cas9 与靶基因的序列完美匹配时，Cas9 的靶向活性和正常功能才能得到保证。有很多工作致力于研究如何检测 CRISPR/Cas 系统的脱靶情况，GUIDE-Seq 高通量测序技术是一种通过高通量实验手段在全基因组范围鉴定 CRISPR/Cas 系统脱靶效应的方法，能够很好地确定脱靶突变的位置以及突变频率。此外，为了使 CRISPR/Cas 系统有针对性地避开可能脱靶的位点，降低甚至消除 CRISPR/Cas 系统的脱靶效应，有研究者也开发了一些辅助软件帮助 CRISPR/Cas 系统对特定基因序列的靶点进行筛选[26]。

因此，虽然 CRISPR/Cas 系统在基因编辑领域中已经取得了不错的成果，但仍然还有很多地方需要进一步改进和完善，如对现有的 CRISPR/Cas 系统递送方法进行优化，合理设计 sgRNA 以最大程度地提高靶标活性并最小化脱靶效应。这些问题如果能够得到解决，CRISPR/Cas 系统势必会迎来更大的发展。

4 总结与展望

利用 CRISPR/Cas 系统可以开发序列特异性抗生素，选择性地靶向细菌的抗生素耐药基因，从而成为一种十分有潜力替代传统抗生素的新型抗菌武器[27]。此外，CRISPR/Cas 系统还能够专一地靶向致病细菌，并且使周围其他的非病原性细菌群体不受CRISPR/Cas 系统的影响。

人类在与病原菌的斗争过程中，因为抗生素的发现和使用而取得了阶段性的胜利，但这种斗争还将持续下去。目前，传统抗生素的研发愈加困难，耐药菌在不断出现与传播，除了对现有抗生素进行规范化管理和合理使用外，研发新型的抗菌药物也迫在眉睫。作为在抗菌治疗领域中尝试的新型疗法之一，虽然 CRISPR/Cas 系统依旧面临着许多问题和挑战，但是仍然为我们研究开发新型抗菌药物提供新的视角和启示。未来，CRISPR/Cas 系统会在人类健康和医学发展方面带给我们更多惊喜。

[1] Xue ZR, Wang YF, Duan GC. Progress on the studies of association between clustered regularly interspaced short palindromic repeat and antibiotic resistance. Chin J Epidemiol, 2015, 36(3):293-296. (in Chinese)

薛泽润, 王颖芳, 段广才. 成簇规律间隔短回文重复序列及其与细菌耐药的研究进展. 中华流行病学杂志, 2015, 36(3):293-296.

[2] Fang KL, Yang H. Advances and applications of CRISPR/Cas toolbox. Chin Sci Bull, 2020, 65(11):973-990. (in Chinese)

方凯伦, 杨辉. CRISPR/Cas工具的开发和应用. 科学通报, 2020, 65(11):973-990.

[3] Xu Y, Cui YX, Yang Y, et al. CRISPR/Cas system resist to bacterial resistance. Asian J Ecotoxicology, 2018, 13(3):1-8. (in Chinese)

徐艳, 崔玉晓, 杨洋, 等. CRISPR/Cas系统抵御细菌耐药. 生态毒理学报, 2018, 13(3):1-8.

[4] Marchfelder A. Special focus CRISPR-Cas. RNA Biol, 2013, 10(5): 655-658.

[5] Ishino Y, Shinagawa H, Makino K, et al. Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J Bacteriol, 1987, 169(12):5429-5433.

[6] Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictionaries of spacers and repeats. BMC Bioinformatics, 2007, 8:172.

[7] Charpentier E, Marraffini LA. Harnessing CRISPR-Cas9 immunity for genetic engineering. Curr Opin Microbiol, 2014, 19:114-119.

[8] Li FL, Shi SH, Li AQ, et al. Research progress of CRISPR/Cas9 gene editing technology. Shandong Agric Sci, 2020, 52(4):164-172. (in Chinese)

李凤丽, 石素华, 李爱芹, 等. CRISPR/Cas9基因编辑技术研究进展. 山东农业科学, 2020, 52(4):164-172.

[9] Makarova KS, Haft DH, Barrangou R, et al. Evolution and classification of the CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol, 2011, 9(6):467-477.

[10] Carter J, Wiedenheft B. SnapShot: CRISPR-RNA-guided adaptive immune systems. Cell, 2015, 163(1):260, e1.

[11] Zhang J, Yang T, Lu YG. Research progress of CRISPR-Cas9 technology in the screening of tumor resistance genes. J Hainan Med Univ, 2020:1-10. Online ahead of print. (in Chinese)

张洁, 杨谭, 卢永刚. CRISPR-Cas9技术在肿瘤耐药基因筛选中的研究进展. 海南医学院学报, 2020:1-10. 优先出版.

[12] Yang P, Sun BB, Yang JJ, et al. The application of CISPR-Cas system in antibacterial resistance. Chin J Antibiot, 2018, 43(8):927-931. (in Chinese)

杨萍, 孙兵兵, 杨俊杰, 等. CRISPR-Cas系统的抗耐药菌应用. 中国抗生素杂志, 2018, 43(8):927-931.

[13] Yao WY, Zeng J, Xue YX, et al. Advances in bacterial drug resistance and new antimicrobial therapy. Chin J Antibiot, 2017, 42(5):321-327. (in Chinese)

姚文晔, 曾洁, 薛云新, 等. 细菌耐药性及新型抗菌疗法研究进展. 中国抗生素杂志, 2017, 42(5):321-327.

[14] Bikard D, Hatoum-Aslan A, Mucida D, et al. CRISPR interference can prevent natural transformation and virulence acquisition during in vivo bacterial infection. Cell Host Microbe, 2012, 12(2):177-186.

[15] Kim JS, Cho DH, Park M, et al. CRISPR/Cas9-mediated re-sensitization of antibiotic-resistant escherichia coli harboring extended-spectrum β-lactamases. J Microbiol Biotechnol, 2016, 26(2): 394-401.

[16] Citorik RJ, Mimee M, Lu TK. Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases. Nat Biotechnol, 2014, 32(11):1141-1145.

[17] Bikard D, Euler CW, Jiang W, et a1. Exploiting CRISPR-Cas nucleases to produce sequence-specific antimicrobials. Nat Biotechnol, 2014, 32(11):1146-1150.

[18] Chen J, Novick RP. Phage-mediated intergeneric transfer of toxin genes. Science, 2009, 323(5910):139-141.

[19] Gang W, Song G, Xu Y. Association of CRISPR/Cas system with the drug resistance in klebsiella pneumoniae. Infect Drug Resist, 2020, 13:1929-1935.

[20] Gomaa AA, Klumpe HE, Luo ML, et a1. Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Cas systems. mBio, 2014, 5(1):e00928-13.

[21] Denyes JM, Dunne M, Steiner S, et al. Modified bacteriophage S16 long tail fiber proteins for rapid and specific immobilization and detection of Salmonella cells. Appl Environ Microbiol, 2017, 83(12): e00277-17.

[22] Lin TY, Lo YH, Tseng PW, et a1. AT3 and T7 recombinant phage acquires efficient adsorption and a broader host range. PLoS One, 2012, 7(2):e30954.

[23] Abedon ST, Kuhl SJ, Blasdel BG, et a1. Phage treatment of human infections. Bacteriophage, 2011, 1(2):66-85.

[24] Zeng JW, Hou GF, Zheng JP, et al. The progress of CRISPR/Cas system used as antimicrobials. China Biotechnol, 2018, 38(11):59-65. (in Chinese)

曾家伟, 侯国锋, 郑继平, 等. CRISPR/Cas系统作为抗菌药的现状及展望. 中国生物工程杂志, 2018, 38(11):59-65.

[25] Zhang YS, Liu J, Wan N, et al. Research progress of CRISPR/Cas technology in microbial field. Clin J Med Officers, 2018, 46(12): 1499-1501. (in Chinese)

张艳双, 刘静, 万楠, 等. CRISPR/Cas技术在微生物领域研究进展.临床军医杂志, 2018, 46(12):1499-1501.

[26] Doench JG, Fusi N, Sullender M, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol, 2016, 34(2):184-191.

[27] Zhang MM, Bi CX, Wang MY, et al. Analysis of the genetic structure of the CRISPR-Cas system in Staphylococcus and its relationship to drug resistance. J Parasitic Biol, 2019, 14(5):553-559. (in Chinese)

张蒙蒙, 毕春霞, 王梦园, 等. 葡萄球菌CRISPR-Cas系统的基因结构及其与耐药基因的关系. 中国病原生物学杂志, 2019, 14(5): 553-559.

昆明医科大学硕士研究生创新基金（2020S197）；云南省基础研究计划[2019FE001(-229)]

胡莹，Email：hy2002@126.com

2020-08-02

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.01.011