鹿红颗粒对心肌缺血再灌注损伤大鼠肠道菌群的影响

杨天舒，瞿惠燕，戎靖枫，刘 茜，周 华

再灌注治疗是有效保护缺血心肌免受梗死的有效方式，但是再次恢复血供后，心肌缺血再灌注损伤常常发生，不仅未能实现正常的心脏功能，反而加重其功能障碍和结构损伤。因此，心肌缺血再灌注损伤已成为心肌缺血病人术后心脏损伤的最主要原因，积极寻找心肌缺血再灌注损伤的机制及解决方法成为亟须解决的关键问题。

肠道作为人体最大免疫器官，在提取能量、控制局部和全身免疫方面扮演着重要角色。研究表明，肠道菌群与多种疾病发生、发展相关，如肥胖、糖尿病、胃肠疾病、癌症和心血管疾病等[1]。其中，肠道菌群与心血管疾病的研究尤为引人关注[2]，其代谢产物如胆碱类物质，可导致心肌纤维化[3]。近年来，随着人们饮食习惯的改变，瘦肉及蛋黄的摄取量增加，导致胆碱类食物食用过量。据报道，与健康人相比，患有冠心病病人的乳杆菌目明显增加，拟杆菌门明显减少[4]。说明患有冠心病的病人与正常人菌群结构有一定差异。鹿红颗粒是上海中医药大学附属曙光医院周华教授运用中医学“益气温阳，活血利水”理论，在总结多年临床治疗心脏重构经验成果的基础上，探索研制而成的中药剂型，由鹿角、桂枝、黄芪、党参、红花和葶苈子组成。方中黄芪、党参益气健脾、扶正固本，对于提高肠道免疫力、调节肠道菌群紊乱有较好疗效；鹿角、红花、桂枝温阳活血，给予肠道血供，防止肠黏膜充血水肿，改善肠黏膜屏障功能；葶苈子利水消肿，促进体循环中胆碱排泄。诸药合用，共奏益气健脾、活血利水之功效。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品、试剂与仪器 鹿红颗粒购自华润三九医药股份有限公司；戊巴比妥钠购自美国Sigma公司(批号：57-33-0)；万古霉素购自上海源液生物科技有限公司(批号：1404-93)。

1.1.2 动物 雄性成年健康无特定病原体(SPF)级Wistar大鼠40只，体质量(180±30)g，8周龄，购自上海中医药大学；饲养于上海中医药大学实验动物中心，饲养室温度25 ℃，湿度30%，光照周期12 h，自由进食普通标准饲料和饮用纯净水。实验伦理证号：PZSHUTCM190322020。

1.1.3 仪器 动物呼吸机，江西特力公司(型号：TRCI-200A)；多导生理信号采集分析系统，美国 BIOPAC公司；全自动免疫分析仪，美国雅培公司(型号AXSYM)；微生物快速检测系统(MB-80)， 北京金山川公司。全自动生化分析仪，美国Abbott公司(型号：AXSYM)；多功能超声诊断仪(型号：IE33)荷兰Philips公司；倒置显微镜(型号：4kx4l)。日本Olympus公司。

1.2 动物分组与造模 按照随机原则对大鼠进行分组，分为假手术组、模型组、鹿红颗粒组、万古霉素组，每组10只。鹿红颗粒组预处理，给予鹿红颗粒0.5 mL/(kg·d)灌胃；万古霉素组给予万古霉素0.075 mg/(300 mL·d)；假手术组、模型组给予等量0.9%氯化钠溶液灌胃。各组预处理灌胃5 d。

Wistar大鼠用2%戊巴比妥钠进行麻醉，行气管插管并用呼吸机辅助通气(通气频率为80次/分、潮气量为2～4 mL)。左侧3～5肋间处打开胸腔，切开心包膜，挤压出心脏后，在肺动脉下2～3 mm处用7号细线结扎冠状动脉左前降支；结扎成功[心室前壁显示苍白色，心电图Ⅱ导联的ST段弓背向上升高(纸速50 mm/s)，表明结扎成功]后，迅速将心脏放回胸腔，然后用浸生理盐水的纱布覆盖胸腔，维持呼吸机呼吸，结扎后40 min再灌注180 min。假手术组只给予开胸后左前降支穿线，但不进行结扎。

1.3 检测指标

1.3.1 血清检测 大鼠处死后，取腹主动脉血，3 000 r/min离心10 min，即得到血清，根据试剂盒操作方法提示，利用全血信息分析系统检测其心功能相关指标肌酸激酶。

1.3.2 病理染色 将大鼠心脏和小肠固定在4%多聚甲醛中，包埋在石蜡中，切成6 μm切片。心脏样品用Masson染色以分析心肌纤维化。小肠用苏木精-伊红(HE)染色以分析组织形态。

1.3.3 粪便取样测序 取大鼠直肠粪便样品(约2粒)收集在无菌管中，短暂存放于液氮中，后储存在-80 ℃等待检测。使用E.Z.N.A.®soil 试剂盒 (Omega Bio-tek， Norcross， GA， U.S.)对总 DNA 进行抽提，利用 Nano Drop 2000检测DNA 浓度和纯度，再用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取的质量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) 引物对V3-V4 可变区间进行PCR 的扩增，扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27个循环(95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s)，最后72 ℃延伸10 min(PCR仪：ABI GeneAmp®9700型)。扩增体系为20 μL、4 μL 5＊FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol dNTPs，0.8 μL引物(5 μmol)，0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA 模板。使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences， Union City，CA，USA) 进行纯化，Tris-HCl洗脱，利用2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST (Promega， USA) 进行检测定量。

2 结 果

2.1 各组大鼠血清肌酸激酶水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清肌酸激酶水平升高(P<0.05)；与模型组比较，鹿红颗粒组及万古霉素组大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.05)；与万古霉素组比较，鹿红颗粒组大鼠血清肌酸激酶水平降低(P<0.01)。详见图1。

与假手术组比较，＊ P<0.05；与模型组比较，# P<0.05；与鹿红颗粒组比较，△ P<0.05。图1 各组大鼠血清肌酸激酶水平比较

2.2 对心肌组织心肌纤维化病理学的影响 使用Masson染色观察心肌组织病理学变化，蓝色染色显示心肌组织中的胶原纤维。与假手术组比较，模型组纤维化程度增加明显；鹿红颗粒组纤维化程度较轻，仅在血管周围显示纤维化反应；万古霉素组较模型组纤维化程度较轻，但在血管周围纤维化程度较鹿红颗粒组重。详见图2。

图2 各组大鼠心肌Masson染色切片图

2.3 对盲肠组织病理学的影响 使用HE染色观察盲肠组织中的病理学变化，假手术组大鼠肠绒毛排列整齐，间隙小；模型组间隙排列紊乱，绒毛间隙大，炎症明显；万古霉素组绒毛排列较整齐，但间隙变大；鹿红颗粒组绒毛排列整齐，较万古霉素组改善了绒毛间隙。详见图3。

图3 各组大鼠盲肠HE染色切片图

2.4 大鼠肠道微生物群群落venn图分析 通过venn图分析发现，不同颜色代表不同分组，重叠部分数字代表多个分组中共有的物种数目，非重叠部分数字代表对应分组所特有的物种数目。通过venn图发现，与假手术组(152)相比，模型组菌群丰度降低(143)；与模型组相比，鹿红颗粒组(165)菌群丰度增加。与模型组(143)及鹿红颗粒组(165)相比，万古霉素组菌群丰度降低(140)。详见图4。

图4 各组大鼠肠道微生物venn图

2.5 大鼠肠道微生物群群落柱形图分析 鹿红颗粒在减缓心肌缺血再灌注损伤的同时影响了肠道微生物组成。模型组明显增加大肠埃希菌(Escherichia)的丰度，假手术组及鹿红颗粒组大肠埃希菌菌群丰度则较低，万古霉素组大肠埃希菌的丰度较假手术组及鹿红颗粒组的丰度提高，较模型组的丰度水平降低。详见图5。

图5 大鼠肠道微生物群落

3 讨 论

心血管疾病与肠道菌群相互联系、相互作用[5-6]。经抗生素干预后，能明显改善心肌损伤。究其机制是通过抑制肠道菌，降低血浆中内毒素水平，改善心肌缺血再灌注损伤。肠源性内毒素攻击发生在89%的急性心肌梗死病人中，并且可能是疾病诱导或进展的一个因素[7]。研究证明，给予抗生素治疗，在第14天效果达到最佳，其后易产生耐药性，易打破菌群平衡，只能短期服用。而给予大鼠饮用水中添加万古霉素，改变了粪便中存在的微生物种类的丰度并减少了总微生物数量。在抑制肠道有害菌的同时也抑制了肠道中“益生菌”[8]，因此，许多临床试验皆以失败告终[9]。近年来，益生元和益生菌已广泛用于治疗某些疾病，并已显示出很好的效果。而益生元品种过于单一，亟须研究多种药物促进益生元及益生菌生长。

《黄帝内经·素问》云：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾。脾气散精，上归于肺；通调水道，下输膀胱”。中药在人体内代谢也要经历此途径。许多中草药并不是本身发挥药效，而是作为药物前体，与肠道菌群相互作用。正常肠道主要的细菌门，按重要性顺序依次是厚壁菌门、拟杆菌、放线菌、变形杆菌、疣粒菌和梭杆菌[10]。大肠埃希菌是人体不可缺少的单细胞生物。大肠埃希菌俗名大肠杆菌(革兰阴性短杆菌)，周身鞭毛，能运动，无芽。大肠埃希菌的致病物质之一是血浆凝固酶。本研究结果证明，鹿红颗粒减缓心肌缺血再灌注损伤的同时影响了肠道微生物组成，明显增加了肠道微生物物种的多样性与丰度。

长期吃低膳食纤维或高脂肪食物会导致肠道菌群失调，其细胞壁结构中的内毒素释放，破坏肠道黏膜，造成肠壁渗漏，并可吸收入血[11]。心肌梗死发生后，导致心排血量减少和体循环淤血，一方面，可以导致肠道血流灌注减少，肠黏膜充血水肿，导致肠黏膜屏障功能破坏。肠黏膜屏障功能的这种破坏反过来可改变肠道通透性、细菌移位、循环内毒素水平。另一方面，可改变肠道菌群的种类与丰度。

鹿红颗粒主要由鹿角、桂枝、黄芪、党参、红花及葶苈子组成，具有益气活血、补肾调心的功效[12]。研究证明，含有纤维、多酚、多糖和某些其他物质的草药配方，通过调节多种肠道微生物群，具有抗肥胖、抗糖尿病和抗心血管疾病的作用[13-15]。鹿红颗粒所含的黄芪多糖、党参多糖、桂枝多糖、党参多酚、桂枝多酚等对于肠道益生菌有明显促进作用[16]。鹿红颗粒通过改善肠黏膜淤血以改善肠黏膜通透性，防治内毒素入血，从而改善心脏炎症，改善心肌纤维化，减缓心肌缺血再灌注损伤。

肠道菌群种类繁多、数量庞杂，与多种疾病关联密切。中医药因其来源天然，且有较少毒副作用，可为改善肠道菌群防治心血管疾病提供新思路。