硫辛酸对大口黑鲈氧化应激相关酶活性的影响

刘品，王文博，罗然丹，鲁瑛，吕洁心

（咸阳师范学院化学与化工学院，陕西 咸阳 712000）

大口黑鲈（Micropterus salmoides），俗称加州鲈，为肉食性鱼类，原产美国加利福尼亚州密西西比河水系。由于其生长迅速、肉质鲜美、抗病力强、适温性广等特点，现已推广全国各地，成为我国重要的淡水养殖品种之一。据2019 年中国渔业统计年鉴，我国2018 年鲈鱼海水养殖产量为166 000 t，淡水养殖产量为432 000 t[1]。近几年，随着驯化养殖技术的提高，可实现大口黑鲈养殖不投喂冰鲜鱼，全程使用配合饲料。然而，大口黑鲈合成高不饱和脂肪酸的能力有限，需要在饲料中添加鱼油等富含高不饱和脂肪酸的油脂[2]。而不饱和脂肪酸极易受到光、热和金属离子等因素的诱导而氧化变质。饲料中脂肪的氧化不仅可削弱其营养价值，还会影响饲料风味，降低鱼类的生长性能和饲料利用效率，引起鱼体氧化应激从而造成病害的发生[3-5]。

在饲料中添加抗氧化剂可以有效改善动物体的氧化应激状况，是一种通过日常饲喂来预防疾病的有效策略。硫辛酸是一种具有强抗氧化性能的天然化合物，能够直接清除众多活性氧自由基（Reactive oxygen species, ROS）；此外可作为金属螯合剂减轻重金属离子对机体的氧化损伤；还能参与体内其他抗氧化剂的再生，因而被誉为“万能抗氧化剂”[6]。近年来，硫辛酸对水产动物的作用研究逐渐增多，目前已发现硫辛酸对鲶鱼[7]、皱纹盘鲍[8]、罗非鱼[9]、鲳鲹[10]、鲤鱼[11]、草鱼[12]和南美白对虾[13]等水生动物具有增强抗氧化性能的作用。

当前，关于硫辛酸对大口黑鲈氧化应激的影响鲜有报道。该试验在已有研究的基础上，通过对大口黑鲈腹腔注射不同浓度硫辛酸（20 mg/kg 和40 mg/kg），研究硫辛酸对血清及肝脏抗氧化相关酶活性的影响，从而为大口黑鲈饲料中硫辛酸的添加提供基础数据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

硫辛酸为淡黄色、黄色结晶性粉末，购于西安泽邦生物科技有限公司，含量为99%。硫辛酸先溶解于少量乙醇后，再用0.65%氯化钠溶液将其稀释成 2 mg/mL 和 4 mg/mL 注射液。总蛋白（TP）、总超氧歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2 试验用鱼与饲养管理

大口黑鲈购自西安草滩渔场，用3% 氯化钠浸泡消毒10~15 min 后放入预先消毒的水箱（30L）内。正式试验前饲养驯化两周。饲养期间每天9：00、13：00、17：00 对其进行投食，每次投喂 30 min，观察记录鱼的进食情况与生长状况。

1.3 试验分组

正式试验前24 h 停止饲喂，选取体质量为（17±0.25）g 的健康大口黑鲈 60 尾，经 3% 的氯化钠浸泡消毒后随机分为对照组（按体质量注射0.65%的氯化钠）、T20组（依体质量注射，硫辛酸终量为20 mg/kg）和T40组（依体质量注射，硫辛酸终量为40 mg/kg），最终使各组相同体重的鱼注射液体量一致。每组20 尾，随机放入对应养殖水箱中，保证每组鱼均重大致相等。

1.4 样品采集

完成试验鱼腹腔注射后，分别于注射后的6 h、12 h、24 h 取样，每次取样 6 尾，50 mg/L 的 MS-222溶液麻醉，之后用2 mL 注射器于试验鱼尾椎静脉采集血液，每组抽取两尾鱼的血液混合得到一个样品，在4 ℃环境中静置4 h 以上，然后3 000 r/min离心10 min，分离血清，-20 ℃保存备用。完成鱼体抽血后进行解剖，分离肝脏，称重后按照1∶9 的体积比加入生理盐水，在冰浴中匀浆后3 000 r/min 离心10 min，分离上清液，-20 ℃保存备用。

1.5 酶活性检测

肝脏总蛋白含量（TP）、总超氧歧化酶（T-SOD）和过氧化氢酶（CAT）活性以及血清过氧化氢酶（CAT）活性采用试剂盒进行测定。测定方法根据试剂盒说明书进行。

1.6 数据分析

对所有数据采用SPSS 17.0 统计软件中的Oneway ANOVA 程序对试验数据进行方差分析，使用Duncans 多重比较分析数据间的差异显著性，显著水平为P<0.05，结果以“平均数±标准差”表示。

2 结果

2.1 硫辛酸对大口黑鲈血清活性的影响

由表1 可见，大口黑鲈注射硫辛酸6 h 后，硫辛酸注射组（T20和T40）血清中CAT 酶活性均显著高于对照组（P<0.05），硫辛酸处理组组间差异不具统计学意义（P>0.05）；注射硫辛酸 12 h 后，T40组 CAT酶活性最高，T20组次之，均显著高于对照组（P<0.05）；24 h 后，各组间CAT 酶活性无差异。此外T20和T40组CAT 酶活性都随着处理时间的延长而逐渐降低，说明腹腔注射硫辛酸可显著提高大口黑鲈血清CAT 酶活性，且有时间与剂量依赖性。

表1 硫辛酸对于大口黑鲈血清CAT 活性影响 U/mL

2.2 硫辛酸对大口黑鲈肝脏CAT 及T-SOD 酶活性的影响

由表2 可以知，腹腔注射6 h 后，硫辛酸处理组肝脏的CAT 酶活性与对照组相比没有差异（P>0.05）；注射 12 h 后至 24 h，T40组 CAT 酶活性显著高于 T20与对照组（P<0.05），T20组与对照组间无差异（P>0.05）。T20和T40组CAT 酶活性都随着处理时间的延长呈现逐渐降低的趋势，对照组则呈现先降低后升高的趋势，说明腹腔注射硫辛酸可显著提高大口黑鲈肝脏CAT 酶活性，且有时间与剂量依赖性。

大口黑鲈腹腔注射硫辛酸后肝脏T-SOD 酶活性变化如表3 所示，与对照组相比，T20组肝脏T-SOD酶活性在3 个时间点均显著增强（P<0.05），T40组肝脏 T-SOD 酶活性在 12 h 内显著升高（P< 0.05），且T20组酶活性显著高于 T40组（P<0.05）。此外，对照组肝脏T-SOD 酶活性随着时间延长而呈现升高趋势，与之相反，硫辛酸处理组肝脏T-SOD 酶活性随着时间延长呈现逐渐降低的趋势。说明腹腔注射硫辛酸可显著提高大口黑鲈肝脏T-SOD 酶活性，但是该促进作用随着时间和剂量的增大而减弱。

表2 硫辛酸对大口黑鲈肝脏CAT 活性影响 U/mgprot

表3 硫辛酸对大口黑鲈肝脏T-SOD 活性的影响 U/mgprot

3 讨论

动物体内的氧化系统与抗氧化防御系统在正常生理情况下是一个动态平衡状态，当机体受到胁迫时，细胞内线粒体形态会发生改变导致功能异常，产生活性氧自由基（ROS）[14]。低水平的 ROS 可通过磷酸酶或磷酸激酶参与细胞的信号传导，维持细胞的正常生理功能，高水平的ROS 则容易攻击细胞内重要的生物分子如脂类、蛋白质和核酸等，引发机体内氧化应激[15]。为了降低ROS 引起的氧化损害，机体内存在多种降低ROS 的酶促和非酶促抗氧化酶体系来发挥抗氧化应激作用。酶促抗氧化剂包括超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）、谷胱甘肽还原酶（Glutathione reductase, GR）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GPx）等，它们能促进ROS 降解、能结合催化ROS 生成的金属（如铁和铜）；非酶抗氧化剂需要在饲料中添加抗坏血酸、α-生育酚、类胡萝卜素、维生素E 和硫辛酸等[16-18]。抗氧化剂通常主要通过防止活性氧自由基（ROS）的产生或清除形成的ROS 来发挥其作用。这些抗氧化剂协同作用，共同维持机体的ROS 平衡。

硫辛酸由于其强抗氧化性越来越受到关注，不仅可以增强生物体的抗氧化性能，还可以作为众多信号通路的有效激活剂参与机体的多种生化调控。硫辛酸分子中有一个二硫键，硫辛酸进入细胞内部其二硫键即被多种酶还原，生成二氢硫辛酸（DHLA），变成硫辛酸的还原形式。DHLA 可以促进其他抗氧化剂的再生，如α-生育酚、抗坏血酸和谷胱甘肽等[19-20]。由于这些特性，硫辛酸可用于改善细胞的抗氧化状态。此外，硫辛酸兼具水溶性和脂溶性，在动物体内被肠道吸收后极易进入细胞发挥生物功能。资料显示硫辛酸可以增强多种动物的抗氧化性能，保护机体免受氧化应激的影响[21-23]。对哺乳动物及人的研究还发现硫辛酸在糖尿病、阿尔茨海默氏症、急性肾衰竭和癌症等疾病的辅助治疗方面可发挥积极作用[20，24-25]。

近年来，学界开始研究硫辛酸作为强抗氧化剂对水生动物的作用。硫辛酸可以显著提高多种水生动物体内不同组织中抗氧化酶活性及非酶抗氧化剂的含量，如 SOD、GPx、CAT 和 GR 等[12，26-27]。Enamorado 等发现硫辛酸可显著提高鲤鱼肝脏、肠道和肌肉的还原型谷胱甘肽的含量[11]。在银鲳鲹的饲料中添加硫辛酸还可以降低其肌肉的脂质过氧化情况，且提高了其脑部的抗氧化状态[10]。Shi 等研究发现硫辛酸可缓解草鱼体内高不饱和脂肪酸的过氧化状态，并促进了非氧化状态的高不饱和脂肪酸在草鱼体内沉积[12]。也有研究者提出通过腹腔注射硫辛酸的方式预防蓝藻毒素等环境因素对鱼类的毒性作用[28]。经腹腔注射硫辛酸的处理已被证明是鱼类中抗氧化剂施用的另一种途径[28-29]。由于动物体腹膜面积大，密布血管和淋巴管，吸收能力强，对外源物质更容易吸收利用。基于此，该研究采用腹腔注射的方式给大口黑鲈幼鱼提供硫辛酸。

酶促抗氧化系中的总超氧化物歧化酶（T-SOD）是一种天然存在于机体内部的超氧自由基清除因子，它可以将有害的O2-转化为H2O2[30]。因此，SOD经常被作为测定抗氧化剂抗氧化能力的一个重要指标。大量研究表明，在饲料中添加硫辛酸能显著提高动物体肝脏 SOD 酶活性[8，12，30]。对猪的研究发现，高脂日粮中添加硫辛酸显著促进了其肝脏SOD 酶活性[31]。对水产动物的研究也有类似发现，Zhang 等报道皱纹盘鲍日粮中添加硫辛酸显著促进了肝胰脏中SOD 的酶活，并且降低了鲍鱼体液中脂质过氧化物的含量[8]。Shi 等在草鱼饲料中添加硫辛酸显著促进了肝脏组织中SOD 酶活性[12]。Xu 等研究发现，饲料硫辛酸在低脂质水平可显著促进中华绒螯蟹肝脏SOD 酶活性[32]。该试验也同样发现，注射硫辛酸后大口黑鲈肝脏T-SOD 酶活性显著提高，与其他动物的研究结果一致。另外，T-SOD 酶活性随着处理时间和剂量的增大而减弱，这与Zhang 等研究皱纹盘鲍的情况类似。皱纹盘鲍饲料硫辛酸添加量低于800 mg/kg 时，肝脏SOD 酶活性显著升高，硫辛酸浓度过高时SOD 酶活性不受影响[8]。但是在中华绒螯蟹中，饲料中低水平的硫辛酸对肝脏SOD 酶活性没有影响，高水平的硫辛酸才能促进SOD 酶活性。该试验研究结果说明硫辛酸可以提高大口黑鲈肝脏SOD 酶活力，进而影响鱼体的抗氧化能力，但是有剂量效应。硫辛酸作为抗氧化剂被添加进大口黑鲈饲料中需注意添加量。

过氧化氢酶（CAT）在机体抗氧化防御中也扮演着重要角色，它可以将 H2O2转化为O2和水，从而使细胞免受过氧化氢的损害[31]。在该试验中，与对照组相比腹腔注射硫辛酸后大口黑鲈血清中CAT 活性在注射后12 h 内显著升高，且CAT 活性随着注射硫辛酸浓度的增加而增强。但随着时间的延长，两个硫辛酸注射组（T20和T40）血清CAT 酶活性呈现逐渐下降的趋势。说明硫辛酸对大口黑鲈血清CAT的影响有明显的时间和剂量依赖性。研究者在奶牛日粮中添加硫辛酸，发现奶牛血清CAT 酶活性也有随时间和剂量的变化而变化的情况[33]。王定发等发现羔羊饲料中添加硫辛酸可以促进其血清CAT 酶活性[34]。该研究还发现不同于血清CAT 酶活性变化规律，肝脏中仅高浓度硫辛酸组（T40）CAT 酶活性显著升高，且是在处理12 h 以后。说明肝脏CAT 酶活对硫辛酸的反应慢于血液循环系统，而且肝脏中CAT 酶活性对硫辛酸敏感性低。陈齐勇等在皱纹盘鲍中发现饲料中添加硫辛酸对其肝脏CAT 酶活性没有影响[35]。而Shi 等在草鱼中发现饲料中的硫辛酸提高了草鱼肝胰脏中CAT 酶活力，但并未影响血清中CAT 活性[12]。相对于饲养试验，该试验采用腹腔注射的方式给大口黑鲈提供硫辛酸，机体更容易吸收利用。硫辛酸通过腹腔注射的方式首先进入血液，然后是肝脏。所以血清CAT 酶活性受硫辛酸影响呈现出剂量和时间相关性，但是肝脏的CAT 酶活性受到硫辛酸的影响相对滞后。而肝脏T-SOD 酶活性对硫辛酸更为敏感，在低浓度T20组即表现出较高的活性。硫辛酸对抗氧化酶活性的影响在不同动物中的研究结果存在一定差异。原因可能与试验方法以及试验对象有关。有关硫辛酸与鱼类抗氧化酶之间的关系还有待进一步的深入研究。

4 结论

硫辛酸作为一种功能强大的抗氧化剂，在动物养殖中用于预防和治疗氧化应激性疾病或损伤的抗氧化功能已经得到了证实。与其他抗氧化剂类似，硫辛酸可用于改善生长、提高存活率、促进免疫反应以及对污染物侵害的抵抗力，并有助于提高鱼类的营养价值。在该研究中，硫辛酸对大口黑鲈血清和肝脏抗氧化酶的活性影响显示出不同的效果，主要取决于硫辛酸注射剂量和分析的组织器官。研究结果表明硫辛酸可以通过促进抗氧化酶的活性改善大口黑鲈的抗氧化应激能力。下一步有必要研究大口黑鲈中硫辛酸的使用剂量与抗氧化能力之间的关系，确定硫辛酸在大口黑鲈养殖饲料中的添加量，以使其抗氧化能力方面的作用最大化，其他不利影响最小化。