花粉块内花粉粒形态观察的扫描电镜样品制备方法

陆 敏 李西林 陆 雄*

（1. 上海中医药大学科技实验中心，上海 201203；2. 上海中医药大学中药学院，上海 201203）

花粉是携带遗传信息的雄性生殖细胞，具有很强的遗传保守性和稳定性，许多细微的形态特征能明显体现出种间的差异和生存信息，在遗传学和分类学中具有重要的科学价值［1］。扫描电镜由于分辨率高，立体感强，图像直观，已被广泛运用于植物孢粉学形态的研究。

植物花粉可分为：①单粒花粉；②2 个以上的花粉粒集合在一起形成的复合花粉，包括2 合、4合、16 合、32 合花粉等，其中以4 合花粉最常见，以及许多花粉粒集合在一起形成的花粉块，如兰科和萝藤科植物［2］。由于花粉块表面具有粘胶物质，被包裹在内的带有粘性的花粉粒紧密粘合在一起，不易分散，难以被直接观察［3］。因此在扫描电镜下花粉块的形态以及花粉块表面的花粉粒形态的研究报道较多，而对花粉块内部的花粉粒的形态鲜见报道［4～8］。解决花粉块内花粉粒的扫描电镜观察样品制备方法这一技术难题，将大大促进植物花粉形态的研究，进一步为植物的分类和鉴定等研究提供科学依据。本研究在常规扫描电镜样品制备的基础上，采用导电双面胶拉断暴露出花粉粒的方法，成功观察到了花粉块内的花粉粒的形态，取得了令人满意的结果。

1 材料和方法

1.1 材料

兰科（Orchidaceae）石斛组（Sect. Dendrobium）翅萼石斛（Dendrobium cariniferumRchb.f.）来自于上海中医药大学中药研究所，由上海中医药大学中药学院李西林教授提供，并经上海中医药大学中药研究所徐红研究员鉴定。

1.2 方法

1.2.1 花粉粒的制备

从自然盛开的新鲜花朵上采集花粉块，立即投入2.5%的戊二醛固定液（pH7.2），4℃，固定2 h以上；用0.1 mol·L-1PBS（pH7.2）洗3 次，每次10 min；1%饿酸后固定3 h；再用PBS 洗3 次，每次10 min；用30%、50%、70%、90%和100%酒精进行梯度脱水后，放入Leica EM CPD300全自动临界点干燥仪中干燥。干燥后的样品用导电双面胶固定在样品托上，在真空下（1×10-6kPa）干燥0.5 h，以增加样品与导电胶的粘合度。用镊子轻轻夹住样品，向上拉，拉断的组织一部分粘在导电胶上，另一部分在解剖镜下使断裂面向上，粘贴在导电胶上。样品粘贴好后，在Leica EM ACE600离子溅射镀膜仪中喷金，镀膜厚度为22 nm，使用Quanta 250 FEG场发射扫描电镜对样品进行观察并拍照，加速电压为10 kV。

1.2.2 花粉块的制备

从自然盛开的新鲜花朵上采集花粉块，在解剖镜下将花粉块不同的面粘贴在导电胶上，立即在离子溅射镀膜仪中镀膜后在扫描电镜下对样品进行观察和拍照。

1.2.3 花粉块的大小测量

在100 倍的放大倍率下测量4 个花粉小块的极轴（P）和赤道轴（E）的长度。

1.2.4 花粉粒的大小测量

在1 000 倍的放大倍率下选取20 粒花粉粒进行极轴和赤道轴长度的测量，P/E 表示花粉粒形状：P/E 在2～1.14 为长球形；P/E＜1.14 为近球形；P/E＜0.88为扁球形；P/E＜0.5为超扁球形［9～10］。

2 结果与分析

2.1 翅萼石斛花粉块形态

翅萼石斛花粉块由4 个花粉小块组成，离生，每2个一对，沿纵轴左右对称。正面观和背面观均呈有弧度的香蕉形（见图1：A～B），侧面观，一端膨大圆钝，一端尖锐，酷似太极图中的阴阳鱼形状（见图1：C）。花粉小块极轴长约为2 mm，中间的花粉小块略长于两边的花粉小块。正面观中间的花粉小块赤道轴长约为600 μm，两边的花粉小块赤道轴长约为400 μm，反面观则相反。放大后观察到翅萼石斛花粉小块表面的花粉粒排列紧密，表面平整，Ⅰ级纹饰呈不规则的多边形，Ⅱ级纹饰为皱痕和类似于毛孔一样的小细孔，推断花粉块表面覆盖有粘胶样物质，相邻花粉粒间的接缝处也可见到明显的粘胶物质（见图1：D）。

2.2 翅萼石斛花粉粒形态

翅萼石斛花粉小块的断裂面上可见密密麻麻的花粉粒（见图2：A～B），放大后显示这些花粉粒是由4个单粒花粉形成的四合体结构，四合体间结合紧密，不易分开，表面具有较浅的脑纹状雕纹，未见萌发孔。四合花粉近似于左右对称，极面观赤道轴长分别约为25 和20 μm，赤道面观极轴长约为10 μm，形态为超扁球形（见图2：C～D）。

3 讨论

目前花粉块内花粉粒的观察通常使用化学试剂醋酸酐或柠檬酸将花粉块上的花粉粒分解下来，在光学显微镜下进行观察［11～12］。此方法由于放大倍数的局限，仅可对花粉粒的形态的进行初步观察。赵昕梅等报道采用化学试剂分解花粉粒后，再按照扫描电镜的样品制备要求进行脱水、干燥等处理，由于花粉粒体积过小在制备过程中遗失，并未观察到花粉粒［13］，表明此方法并不适合扫描电镜下花粉块中花粉粒的观察。孙崇波等人报道通过铁骨素兰花花粉块中散落出来的花粉粒，观察到了类似四分体的结构［14］，但这种观察是由于操作中的偶然性出现的，并没有形成系统的方法。

对于组织内部结构的观察，扫描电镜通常的制备方法有：①内部结构剖出法，包括刀片切断法、镊子掰开法、双面胶带拉断法、环氧树脂割断法以及冷冻割断法；②管道铸型法；③离子蚀刻法［15］。植物花粉扫描电镜样品制备方法的报道多集中于单粒花粉，既有花粉粒表面形态观察的制样方法［16～17］，也有花粉粒内层结构观察的制样法，例如花粉粒冷冻断裂法、花粉粒冰冻蚀刻法、花粉粒树脂断裂法等［18～19］，但目前尚无针对花粉块内花粉粒制备方法的报道。

本实验以石斛属植物中花粉块体积相对较大的翅萼石斛为材料，采用导电双面胶带拉断花粉块的方法，暴露出花粉块中的花粉粒，在扫描电镜下清晰观察到了翅萼石斛花粉粒的立体形态与其上的纹饰，并在扫描电镜下首次证实了翅萼石斛的花粉块是由单粒→四合体→花粉小块→花粉块的形式组成的。此方法简单易行，操作方便，不需要额外的试剂和仪器，再进行一定的优化后，可作为扫描电镜下观察花粉块中花粉粒形态的一种通用方法，将有助于对兰科、萝藤科植物的花粉形态进行进一步的深入研究。