一步法构建莱茵衣藻叶绿体表达载体

刘国兴，胡玉立，徐丹丹，徐 松

（国药集团动物保健股份有限公司 湖北，武汉 430075）

莱茵衣藻是一种生活在淡水里的单细胞真核绿藻，其叶绿体表达的外源蛋白具有安全性好、培养周期短、遗传稳定、容易扩大培养，并且成本低廉等优点[1,2,3]。近些年来，多种具有应用前景的蛋白在莱茵衣藻叶绿体中成功表达[4]。而一般构建衣藻叶绿体表达载体需要通过两步克隆来完成：首先将外源基因插入克隆载体的衣藻来源的5’和3’非翻译区（UTR）多克隆位点间，再将5’UTR-外源基因-3’UTR的表达盒酶切下，通过同源重组构建至表达载体[5,6]。为了简化衣藻叶绿体表达载体的构建步骤，本研究构建了一种T载体pBTNK，通过一步TA克隆可将待表达的外源基因插入衣藻来源5’和3’UTR 之间，蓝白斑筛选获得阳性转化子后，重组质粒可直接用于转化植物，因此可简化衣藻叶绿体中表达载体构建流程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株和质粒 莱茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii137c (mt)、质粒 pCX16、pCX13、p228 由华中农业大学陈杏洲博士惠赠；大肠杆菌DH10β，质粒pShuttle、pFAST-EGFP、pT-BASIC由湖北大学蒋思婧博士惠赠。

1.1.2 酶、主要试剂和设备 BfuI 购自Thermo Scientific，LATaq酶、SolutionI 连接酶、T4DNA 聚合酶、质粒抽提试剂盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、其他限制性内切酶，购自 Takara 公司，X-gal、dNTP、硫酸卡那霉素（kana）、氨苄青霉素购自北京九州同业生物科技公司，壮观霉素购自sigma公司，PCR引物（表1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Biolistic PDS-1000/He基因枪购于Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 DNA 克隆 质粒提取参照OMEGA bio-tek 试剂盒说明书进行，DNA片段克隆、重组质粒鉴定等分子克隆操作参照Sambrook提供的方法进行[7]。

1.2.2 莱茵衣藻叶绿体转化 根据文献[8]描述的方法并适当调整后，通过基因枪法将基因导入叶绿体，即3μg载体质粒pTBNK-EGFP（1μg/μl）和2μg 抗性质粒p228（1 μg/μl）包被50μl（60 mg/mL）直径为0.6μm金粉子弹，按压力1100psi、真空度28英寸汞柱、目标距离6cm轰击衣藻，将轰击后的衣藻在TAP平板上暗培养15～20h后刮下，涂布于5皿含100μg/mL壮观霉素抗性TAP平板，培养两周。

1.2.3 叶绿体总DNA提取 衣藻叶绿体总DNA的抽提采用CTAB法[9]。

1.2.4 莱茵衣藻的培养 将莱茵衣藻培养在TAP 液体培养基或含1%琼脂糖的固体平板上，在22℃～24℃、连续光照（约100 μE/m2.sec-1）条件下培养[10]。

2 结果

2.1 衣藻叶绿体表达载体pTBNK的构建

以质粒pCX16为模板，P1和P2为引物，LATaq酶PCR扩增5.7kb 同源臂上的2.0 kb 片段，回收PCR 产物后，用BamHI和SphI双酶切并回收该2.0 kb片段，然后将酶切的片段插入pCX16 载体的BamHI 和SphI 酶切位点间，在pCX16 载体上引入NotI 酶切位点得到载体pCXN；EcoRI和SphI 双酶切载体pCXN，回收pCXN 载体骨架5.7 kb 片段，并用T4DNA 聚合酶补平末端，将末端补平片段插入pT-BASIC 的EcoRV 酶切位点得到载体pTBN；以质粒pShuttle 为模板、P3 和 P4 为引物，LATaq酶 PCR 扩增 1.2 kb kana 抗性基因片段，将该片段回收后，BglⅡ和HindⅢ双酶切该片段，然后将酶切后的片段插入pCX13 载体的BglⅡ和HindⅢ酶切位点间获得载体pCX13-kana；用BamHI 将 pCX13-kana 载体上 5’UTR-BfuI-kana-BfuILacO 部分序列-3’UTR 表达盒酶切下，T4 DNA 聚合酶补平末端，然后和NotI 酶切、T4DNA 聚合酶补平末端的pTBN 载体片段用SolutionI 连接酶进行连结，获得衣藻叶绿体定向表达T载体pTBNK（图1）。

2.2 一步克隆构建衣藻叶绿体表达载体pTBNK-EGFP

以 pFAST-EGFP 为模板，P5 和 P6 为引物，LAtaqPCR扩增 EGFP 基因并回收该产物，BfuI 酶切 pTBNK 载体，连接后转化至大肠杆菌DH10β 感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素（50μg/ml）和X-gal（30μg/ml）的LB固体平板上，避光培养12～14h 后观察，挑显蓝色的菌落（图2）进行PCR鉴定（图3）。经鉴定，阳性克隆达100%，表明重组衣藻表达载体pTBNK-EGFP构建成功。

2.3 表达载体pTBNK-EGFP导入衣藻叶绿体

pTBNK-EGFP 经基因枪法转化莱茵衣藻叶绿体后，经100μg/mL壮观霉素抗性筛选，共长出4个绿色单藻落，抽提野生型的叶绿体总DNA和第八次传代的转基因衣藻的叶绿体总 DNA 作为模板，以 P5 和 P6 为引物，PCR 扩增EGFP片段，结果显示四个转基因衣藻DNA样本中均可以扩增出目的条带而野生型DNA样本无法成功扩增目的条带（图4），表明EGFP成功插入莱茵衣藻叶绿体。

3 讨论

我们设计在载体克隆位点引入BfuI 酶切位点，该酶的特点是特异性识别5’-gtatcc-3’序列，并在该序列下游任意6 个碱基处对DNA 进行切割，切割后形成粘性末端“T”，而LAtaqDNA 聚合酶扩增的目的片段带“A”尾。这样，可通过TA克隆将目的片段克隆到pTBNK。

基于LacO重构原理[11]，在PCR 扩增目的片段的下游引物5’增加7bp的部分LacO序列（5’-CACAATT-3’），载体骨架上携带 13bp 的部分LacO序列（3’-AATTGTGAGCGCT-5’），载体片段和目的片段连接后，转化到lac+的菌株感受态细胞，涂布于含X-gal的平板，完整的LacO序列会竞争性的吸附宿主菌表达的LacI 蛋白，使宿主菌的乳糖启动子控制的β-半乳糖苷酶基因表达解抑制，表达β-半乳糖苷酶，分解X-gal使菌落呈现蓝色。因此，只有目的基因阅读框正确插入克隆位点组成完整LacO序列才会使菌落显蓝色，而基因阅读框反向插入或空载体，菌落均呈白色。统计显示，EGFP基因克隆至该载体并转化后，蓝色菌落占总菌落数的50%～60%，而且蓝色菌落均为阅读框正确插入的重组子（图3）。

图1 衣藻叶绿体定向表达T载体构建流程图

图2 蓝白斑筛选重组子平板

图3 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～2200：蓝斑菌落PPCCRR扩增EEGGFFPP基因；2211～2255：白斑菌落PPCCRR扩增

本实验构建衣藻叶绿体表达载体pTBNK，克隆效率高、筛选方法简便、耗时短、成本低，而且不受酶切位点的影响，具备通用性，且重组子可通过蓝白班筛选，优于传统的两步法酶切构建表达载体[7,11]。遗憾的是，本实验中EGFP未表达。尽管如此，该构建方法极大简化外源基因插入莱茵衣藻叶绿体表达载体的步骤，载体构建思路也可能适用于其他叶绿体表达载体的构建。

图4 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～5：转基因衣藻抽提总DDNNAA作为模板PPCCRR 扩增EEGGFFPP 基因；6：野生型衣藻抽提总DDNNAA 作为模板PPCCRR扩增EEGGFFPP基因