电位滴定法研究单宁酸去质子化特性

张亮亮，张 禾，徐 曼，胡新宇，刘义稳

(1.中国林业科学研究院 林产化学工业研究所；生物质化学利用国家工程实验室;国家林业和草原局林产化学工程重点实验室；江苏省生物质能源与材料重点实验室；江苏省林业资源高效加工利用协同创新中心，江苏 南京 210042;2.五峰赤诚生物科技股份有限公司，国家林业和草原局五倍子高效培育与精深加工工程技术研究中心，湖北 宜昌 443413)

单宁酸又称鞣酸，属于水解类单宁，其水解产物为棓酸和葡萄糖，是最早进行研究及开发利用的单宁之一，具有很强的生物和药理活性，在医药、食品、日化等方面具有广泛的应用[1]。单宁酸主要存在于中国五倍子、土耳其倍子、塔拉果荚、石榴、漆树叶等植物中[2]，其所具有的一系列独特的性质引起了国内外学者广泛关注。其中五倍子是中国的林特产品，是用来生产单宁酸的主要原料。单宁酸组分复杂，由不同聚体的棓酸组成，其中五聚体1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(PGG)是由5个没食子酸与一个葡萄糖通过酯键结合而成。酚类物质具有能够和金属离子络合的共性，多酚羟基一般是以氧负离子的形式与金属离子络合。未电离的酚羟基虽然也可以参加配位，但其络合的稳定性比离解的氧负离子差很多。因此单宁与金属离子络合由两部分反应组成，首先是酚羟基离解，然后氧负离子(R—O-)作为配体与金属离子进行配位络合[1]。单宁表现为弱酸性，单宁-金属离子络合反应过程可以看成是溶液中质子与金属离子同酚羟基上带负电荷的氧离子相互竞争结合的过程[3-5]。然而由于单宁酸组成成分复杂，化学结构中含有多个棓酰基，在溶液中的解离过程及平衡十分复杂，因此对溶液中酸解离常数的测定及其相关溶液配位化学作用的研究较为困难。本实验利用一种单宁酸五聚体PGG及其组成单体化合物没食子酸甲酯(MeG)作为模型化合物，采用pH电位滴定法及分光光度法研究其酚羟基去质子化过程并测定其离解常数，得到了PGG的各级解离常数及其溶液中的化合物分布，为进一步深入开展单宁酸与溶液中金属离子的相互作用机理研究提供了基础。

1 实 验

1.1 仪器与试剂

Agilent Cary 8454紫外-可见分光光度计，美国安捷伦公司；FE20型pH计，瑞士梅特勒-托利多公司。PGG(纯度>99%)购自成都普瑞法科技开发有限公司；MeG(纯度>99%)购自北京绿源伯德生物科技有限公司，用50%甲醇溶液配成浓度为1 mmol/L的PGG、MeG反应溶液，溶液中PGG、MeG准确浓度经吸光系数进行校正。甲醇、盐酸、氢氧化钠均为分析纯；试验用水为去离子水。PGG、MeG化学结构见图1。

图1 1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(PGG)及没食子酸甲酯(MeG)的化学结构Fig.1 Chemical structures of PGG and MeG

1.2 实验方法

1.2.1pH滴定试验 在比色皿中加入980 μL甲醇和1 μL浓度为1 mol/L的盐酸溶液，充分混合后；再加入20 μL浓度为1 mmol/L的PGG或MeG溶液，充分混合后，用微量加样器逐次向混合溶液中加入浓度为10 mmol/L的NaOH溶液，每次10 μL，共加入NaOH溶液总体积为320 μL；每次滴加后充分混合，并静置1 min使其充分反应。用分光光度计记录混合溶液在200～600 nm处的吸光度，制作吸光度曲线，同时用pH计测定混合溶液的pH值。滴定试验重复3次，PGG溶液及NaOH溶液均需当日配制使用。

1.2.2数据处理 化学计量学软件Reactlab Equilibrium[6]是一款由澳大利亚纽卡斯尔大学化学专家研发，用于多组分体系配合物稳定常数精确计算的优秀的化学计量学分析软件。该软件主要用于有机化合物与金属离子络合反应结合常数及化学计量比的计算，以及处理由酸碱电位滴定法得到的多组分配合物系统的实验数据，既适合解离常数的计算，又能用于各种类型的配合物稳定常数的计算，并通过对实验数据进行模拟计算得到不同pH值时体系中各组分的分布图。本研究所有实验数据均采用Reactlab Equilibrium软件程序在计算机(Windows 7操作系统，预装Microsoft Office Professional 2010)上处理。

2 结果与讨论

2.1 单宁酸(PGG)离解常数的测定

实验运用pH电位滴定法结合光谱学技术，用10 mmol/L的NaOH溶液对1.0 mL浓度为0.02 mmol/L的PGG(预加盐酸溶液)溶液进行滴定，重复3次，得到滴定光谱(图2)，溶液的吸光度值随pH值的变化见图3。

图2 NaOH滴定PGG溶液吸收光谱变化Fig.2 Spectral changes of PGG titrated with NaOH

图3 不同pH值下溶液的吸光度值变化Fig.3 The absorbance of solution at different pH value

由图2可见，PGG溶液的特征吸收峰出现在220和280 nm处，与文献[7]报道的结果一致。随着溶液中pH值的升高，其在280 nm处的特征吸收波长表现出向326 nm处红移，表明PGG结构中的棓酰基团上的酚羟基发生了去质子化反应。单宁酸结构中的酚羟基去质子化会引起芳香环上电子分布的改变，从而导致单宁酸光谱特征吸收波长出现红移现象[8]。随着混合溶液pH值的升高，溶液在326 nm处的吸光度值呈“S”型变化趋势(图3)，随着pH值的升高PGG结构中的酚羟基开始离解并失去质子，当pH>11后PGG分子达到完全去质子化状态。

运用化学计量学软件对电位滴定实验数据进行分析计算得到随着溶液pH值的升高，PGG分子在溶液中共存在两种去质子化状态，分别为PGG-D1和PGG-D2(见图4(a))，并计算得到两个离解常数分别为pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。对照实验光谱数据发现PGG-D1和PGG-D2状态下的pH值分别为10.69和11.55(见图4(b))。

a.计算值calculated value；b.实验值experimental value图4 质子化的PGG及其两种去质子化状态(PGG-D1和PGG-D2)光谱图Fig.4 The computed spectra of the fully protonated PGG and its two deprotonated forms

从实验光谱与化学计量学软件计算得到的模拟光谱对比来看，计算结果与实验光谱特征吸收峰吻合很好，所得离解常数的误差也很小，因此，Reactlab Equilibrium软件的计算结果是较为合理可靠的。

2.2 没食子酸甲酯(MeG)离解常数的测定

水解类单宁化学结构中的没食子酸酰基结构是水解类单宁结构中主要的活性基团，是单宁酸与金属离子进行配位络合的功能基团[9-10]。作为单宁酸的功能活性基团，虽然没食子酸是水解类单宁降解后的主要产物，但由于没食子酸化学结构中羧基的存在会对研究酚羟基离解产生一定的干扰，而没食子酸甲酯(MeG)更适合作为单宁酸中酚羟基去质子化研究，及其与金属离子配位反应研究的模型化合物，故本研究考察了MeG的去质子化过程。实验运用pH电位滴定法结合光谱学技术研究了MeG的去质子化过程。随着溶液中pH值的升高，MeG溶液吸光度曲线表现出与PGG相似的变化趋势(见图5(a))，其特征吸收峰从270 nm逐渐红移至320 nm处，同时溶液在320 nm处的吸光度值同样呈“S”型变化趋势(图3)。随着pH值的升高MeG结构中的酚羟基团开始离解并失去质子，当pH>10后MeG达到完全去质子化状态。运用化学计量学软件计算得到其离解常数为pKa=9.68±0.02，并且随着溶液pH值的升高，MeG分子在溶液中只有一种去质子化状态(MeG-D1，见图5(b))，即苯环上只有一个酚羟基失去一个氢原子形成氧负离子。相比于其衍生物PGG，MeG具有更小的离解常数，即更容易发生离解反应及与金属离子进行配位反应。

图5 不同pH下MeG溶液的光谱(a)及其模拟计算得到的质子化MeG/去质子化(MeG-D1)光谱(b)Fig.5 Spectral of MeG at different pH(a) and the computed spectra of the fully protonated MeG/deprotonated MeG(MeG-D1) by Reactlab Equilibrium software(b)

多酚化合物因其结构中存在大量的邻苯二酚基团，具有众多可以与金属离子进行络合的结合位点。PGG分子中由5个没食子酸围绕中心一个葡萄糖核通过酯键连接而成，即每个PGG分子中存在5个棓酰基结构[11]。文献研究发现，每个棓酰基可以结合一个金属离子[12-14]，因此理论上每个PGG分子最大应该可以结合5个金属离子，但目前有关1个多酚化合物分子可以结合超过3个金属离子的情况鲜见报道。作者课题组前期研究发现，每个单宁酸(PGG)分子最多可以结合2个Fe3+或Al3+离子[13,15]。这可从PGG的空间结构进行解释，Feldman等[16]研究发现，PGG结构中的5个棓酰基像5条“手臂”一样围绕着葡萄糖核，并非自由地分布在同一个平面上，事实上5条“手臂”中的3条分布于葡萄糖核的一侧，而剩下2条则分布于葡萄糖核的另一侧，形成两束具有众多羟基的空间上相互分开的“尾巴”，每束这样的“尾巴”只能够结合一个Fe3+或Al3+离子。

综上可知，每个PGG分子最多只能发生去质子化失去两个质子，而每个棓酰基团上只有一个酚羟基会发生离解失去质子，即每个PGG分子中最多有两个棓酰基团发生了去质子化形成氧负离子形式，从而进一步可以与金属离子发生配位反应，形成PGG-2Fe或PGG-2Al络合物。根据以上研究结果，可以使得单宁酸在溶液中的去质子化过程及其与金属离子的络合反应机制更加清晰(见图6)。随着溶液pH值的升高(pH>4)，PGG结构中的酚羟基开始离解并失去质子，去质子化的PGG可以与金属离子进一步发生配位反应生成金属离子配合物；当pH>11后PGG分子达到完全去质子化状态，该状态在溶液中极不稳定，很快转化为氧化状态。

图6 单宁酸在溶液中的去质子化过程及其与金属离子的络合反应机制Fig.6 Proposed mechanism of deprotonation and metal ion complexing reaction of PGG

3 结 论

3.1采用pH电位滴定法结合光谱学方法揭示了单宁酸化合物PGG的去质子化特性，结果显示：随着溶液pH值的逐渐升高，单宁酸化合物PGG分子中共有两个酚羟基依次发生了去质子化，其离解常数分别为pKa1=10.84±0.03和pKa2=10.62±0.02。MeG分子只有一个酚羟基会发生质子化反应，其离解常数pKa=9.68±0.02。

3.2揭示了单宁酸在溶液中的去质子化过程，并进一步阐明了单宁酸与金属离子的络合反应机制。随着pH值的升高(pH>4)，PGG结构中的酚羟基开始离解并失去质子生成氧负离子，并进一步与金属离子发生配位反应生成金属离子配合物。