响应面法优化铁皮石斛花总黄酮的提取工艺

陈润泽

（浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300）

1 材料与仪器

铁皮石斛花于2019年6月采摘于浙江省临安市天目山镇横塘村麻泥角弄智能温棚（N 119°26′11″，E 30°20′30″，海拔280 m），经浙江农林大学斯金平教授鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛盛开的鲜花。鲜花经90℃下杀青，60℃下烘干后备用。芦丁标准品，纯度≥98%，上海源叶生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；实验用水均为去离子水（实验室自制）。

酶标仪，美国MD公司；电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；恒温电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；高速离心机，德国Heraeus公司。

2 试验方法

2.1 铁皮石斛花总黄酮的提取流程

取少量烘干备用的铁皮石斛花磨粉，按物料比溶于不同浓度的乙醇溶剂中，在超声波仪中提取一段时间后低温离心，取上清液过膜，即制得铁皮石斛花总黄酮提取液。

2.2 芦丁标准曲线的制作

配置浓度为0.8 mg·mL-1的芦丁对照品溶液，精密吸取 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、2.0 mL 芦丁对照品溶液于25 mL容量瓶中，加80%的乙醇溶液补足至2 mL。依次加入5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min；加入10%硝酸铝溶液1 mL摇匀放置6 min，再加入4%氢氧化钠溶液10 mL，用80%乙醇定容至25 mL，摇匀放置15 min后在酶标仪510 nm波长处测定吸光度并绘制标准曲线（纵坐标为吸光度A，横坐标为芦丁质量浓度C）。

2.3 总黄酮含量的测定

取0.500 0（±0.003）g铁皮石斛花置于50 mL离心管中，按照物料比加入一定体积的乙醇溶剂，超声一段时间后冷却至常温经4 000 rpm，离心10 min，取上清液过膜得样品溶液。取2 mL所得溶液采用2.2中的方法测定含量。

式中：C为显色液中总黄酮的质量浓度（mg·mL-1）；V为显色液的体积（mL）；M为样品的质量（g）；N为稀释倍数。

2.4 单因素试验

乙醇提取浓度：按照 20∶1 的物料比（mL·g-1），超声温度40℃，超声时间30 min，考察不同乙醇提取浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对总黄酮得率的影响。

物料比：乙醇提取浓度为70%，超声温度40℃，超声时间 30 min，考察不同物料比（30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 mL·g-1）对总黄酮得率的影响。

超声时间：乙醇提取浓度为70%、物料比（mL·g-1）为50∶1，超声温度40℃，超声时间30 min，考察不同超声时间（20、30、40、50、60 min）对总黄酮得率的影响。

2.5 响应面法优化

根据Box-Benhnkende的中心组合设计原理，以单因素试验的结果为依据，以乙醇浓度（A）、物料比（B）、超声时间（C）作为考察因子，以铁皮石斛花总黄酮得率（Y）作为试验指标，进行响应面回归模型设计，因素及水平编码见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素与水平值

3 结果与分析

3.1 标准曲线及单因素试验结果

芦丁标准曲线和单因素对铁皮石斛花总黄酮提取率的影响见图1。本试验的标准曲线为Y=0.5202X-0.0064，相关系数R2=0.999 7，X为芦丁质量浓度，Y为吸光度，n=6。可见芦丁标准曲线具有良好的线性关系，可用于计算铁皮石斛花总黄酮的含量。铁皮石斛花总黄酮提取率随着乙醇浓度的增加出现先升高再下降的趋势，故最佳乙醇浓度为70%；随着物料比的增加，总黄酮提取率先上升再下降，物料比 1∶50（mL·g-1）最佳；总黄酮提取率含量随着超声提取时间的增加而增加，超声时间超过30 min后总黄酮含量反而降低，故选用30 min为宜。

图1 芦丁标准曲线及单因素试验结果

3.2 响应面试验结果与回归模型方差分析

响应面回归模型试验结果和方差分析结果见表2和表3。通过Design-Expert软件回归拟合上述实验结果，得到下方实际因素回归方程：

表2 Box-Behnken响应面试验设计及结果

表3 Box-Behnken回归模型的方差分析

Y=-49.01526+2.17992A+0.610074B+0.177693C-0.003158AB+0.000054BC+0.005726BC-0.014306A2-0.005659B2-0.006764C2。其中，响应值Y为铁皮石斛花总黄酮的得率。

根据表3方差分析的结果可知，该模型的P值小于0.01，即回归模型与实际测量值拟合程度很高。显著性因素包括BC、A2、B2、C2（P＜0.05），而A、B、C、AB、AC不显著因素（P＞0.05）。如表3所示，失拟项表现为不显著（P值为0.276 5），说明回归模型与实际测量值能较好地拟合。各因素的F值大小可以反映试验因素对铁皮石斛花黄酮得率的影响，F值越大，说明其对总黄酮得率的影响越大。由表 3 可知，F（A）=0.53，F（B）=0.03，F（C）=4.71，且 F（C）＞F（A）＞F（B），即各因素对铁皮石斛花黄酮苷类成分得率的影响顺序为超声时间＞乙醇浓度＞物料比。

3.3 响应面各因素交互作用

三维空间响应面如图2所示，如果响应值对系数的变化更敏感，则表面性能将更陡峭。如果响应值对系数的变化不敏感，则曲面性能将更平滑。从图中可知，超声时间对总黄酮得率的影响最大，超声时间的改变会对铁皮石斛花总黄酮得率造成极大影响，物料比和超声时间的交互作用则影响相对较小。

图2 各因素交互作用对总黄酮得率的影响

3.4 响应面模型验证

采用响应面优化的最佳工艺参数为：乙醇提取浓度为 70.63%，物料比为52.46∶1（mL·g-1），超声时间34.68 min，理论提取率为18.77 mg·g-1。考虑到实际提取情况，将提取条件设置为：乙醇提取浓度为70%，物料比为 52∶1（mL·g-1），超声时间 34 min。在此条件下，铁皮石斛花总黄酮的得率为19.50 mg·g-1，与预测结果相符，说明该模型较好的预测铁皮石斛花总黄酮的提取率，优化工艺可靠。

4 结论

本研究采用响应面法对铁皮石斛花超声辅助提取总黄酮工艺进行优化，得到最佳的提取工艺条件为：乙醇提取浓度为 70%，物料比为 52∶1（mL·g-1），超声时间34 min，在此条件下铁皮石斛花总黄酮的提取率为3.9%。与已报道的单因素优化工艺（总黄酮提取率1.99%）相比，响应面法优化后总黄酮提取效果更好。该研究结果为铁皮石斛花的资源开发利用提供了一定的理论基础。