2个玉米光敏色素C基因的克隆及功能验证

丁武思，陈士瞻，刘 磊，樊晓聪，丁梦月，孙广华，王立建,2，杨建平

(1.河南农业大学 农学院，河南 郑州 450046； 2.河南警察学院，河南 郑州 450046)

玉米(Zeamays)是世界上总产量最高的粮食作物，其总产量占全球谷物总产量的37.2%[1]。随着食品、饲料和工业产品对玉米需求量的递增，提高玉米单产显得十分必要[2-4]。耐密品种可以有效提高玉米单产，在过去的几十年里，耐密玉米品种的推广对美国和我国等国家的玉米持续增产做出了重要贡献[5-8]。但是随着种植密度的增加，植株间相互遮挡，造成光照不足，玉米出现徒长、茎叶夹角变小、早花、倒伏甚至空秆等避荫性综合反应(Shade-avoidance syndrome，SAS)[9-13]，严重制约玉米单产的进一步增加。环境中光照的变化能显著影响玉米的株型、开花期、产量和品质等[14-19]。因此，探索自然界光能高效利用是进行玉米产量和品质改良的重要途径[14]。

植物通过光受体感知光质、光强和光照节律的变化，及时调控自身的生长与发育进程。植物的光受体主要分为三大类，即红光及远红光(600～750 nm)受体光敏色素(Phytochrome，PHY)，蓝光及UV-A(320～500 nm)受体隐花色素(Cryptochrome)和向光素(Phototropin)、UV-B(282～320 nm)受体等[20-22]。其中，光敏色素类蛋白通常形成同源或异源二聚体，其N端形成的疏水区以共价键的方式结合线性四吡咯生色团，负责感受光的变化；C端负责信号传递及核定位，是2个光敏色素分子形成二聚体所必需的结构区段[23-24]。光敏色素参与调节植物从萌发到成熟的整个生长发育过程，也参与昼夜节律生物钟调控[25-26]。研究玉米光敏色素在光形态建成中的功能，可为改善玉米株型、提高玉米产量奠定理论基础。

模式植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)包含5个PHY基因，PHYA—PHYE[27-28]，对拟南芥光敏色素的研究较深入，但主要集中在PHYA和PHYB上，PHYC、PHYD和PHYE的研究相对薄弱。按照光敏色素在光照条件下的稳定性，可以将它们分为光不稳定型和光稳定型[29]。其中，PHYA属于光不稳定型，是最主要的远红光受体，介导远红光高辐照反应(Far-red-high-irradiance responses,FR-HIRs)和极低辐照反应(Very-low-fluence responses，VLFRs)；PHYB、PHYC、PHYD和PHYE属于光稳定型，是主要的红光受体，介导低辐照(Low-fluence responses，LFRs)反应，并且PHYB起主导作用[30-31]。与野生型相比，phyC突变体幼苗对持续红光的敏感性降低，表现出下胚轴变长和子叶变小；在拟南芥中，尽管PHYC含量不高，但却参与了植株弱红光下幼苗的去黄化和子叶增大，同时也是短日照条件下的开花抑制因子[32-33]。

在禾本科植物中，光敏色素基因只有3个亚家族：PHYA、PHYB和PHYC[14]。玉米的远古种基因组经过了四倍体化的过程，由2个相近的禾本科物种杂交而来，而每个物种都携带一套PHYA、PHYB和PHYC，随后的去四倍体化过程中光敏色素基因并没有被去除，导致玉米基因组有3对光敏色素基因PHYA1、PHYA2，PHYB1、PHYB2，PHYC1、PHYC2[34]。水稻(Oryzasativa)PHYC基因参与光形态建成的调节，phyA/phyB/phyC三重突变体黄化反应极强，且胚芽鞘和叶片增长[35]。另外，PHYC基因能抑制水稻在长日照条件下的开花，水稻phyC突变体在长日照条件下提前7 d开花，phyA/phyC双突变体的开花期更加提前[35-36]。在小麦(Triticumaestivum)中，phyC突变体在长日照和短日照条件下分别推迟开花108 d和19 d[37]。近期的研究表明，ZmPHYB1和ZmPHYB2可以促进玉米的生长，增加玉米生物量和产量[38]。

在玉米中，对于PHYC的研究相对滞后，它们在玉米生长发育过程中的功能尚不清楚。ZmPHYC1和ZmPHYC2对各种光质和光周期处理均有较强的响应，推测二者在调控玉米光形态建成和开花中具有重要作用[26]，但其具体功能尚不清楚。为此，克隆玉米的2个PHYC基因，转化拟南芥phyC-2突变体和野生型Col-0，对ZmPHYC1和ZmPHYC2进行功能验证，并探讨玉米与拟南芥PHYC功能的异同，以及ZmPHYC1和ZmPHYC2二者在光形态建成和避荫性反应中作用的差异，从而为玉米的开花期、株型和产量等重要农艺性状的改良提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 玉米自交系B73由李新海博士赠送、杨建平实验室繁育并保存，拟南芥突变体phyC-2由美国加州大学伯克利分校Peter QUIAL教授赠送，拟南芥哥伦比亚野生型(Col-0)、大肠杆菌DH5α感受态、农杆菌GV3101感受态和植物表达载体pJIM19-Myc由杨建平实验室繁育并保存。

1.1.2 试验试剂 快速质粒小提试剂盒(DP105-03)、琼脂糖胶回收试剂盒(DP209-03)、反转录试剂盒(KR106-02)和通用型DNA纯化回收试剂盒(DP214-03)均购于天根生化科技公司；Trizol试剂盒(Invitrogen，USA)购于赛默飞世尔试剂公司；限制性内切酶购于NEB公司；无缝克隆ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(C113)购于诺唯赞生物科技公司；2×KOD One PCR酶反应混合液购于ToYoBo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白理化性质、结构域预测与系统进化分析 使用ProtParam网站(http://web.expasy.org/protparam)对ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白的分子质量和等电点等进行分析，并且使用SMART网站(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析其结构域；用DNAMAN(Version 8.0)软件对这2个蛋白质以及二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、水稻和拟南芥的PHYC蛋白结构域进行序列比对；利用NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)获得模式植物拟南芥PHYA—PHYE蛋白，其他双子叶植物番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanumtuberosum)、葡萄(Vitisvinifera)，禾本科植物小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvulgare)、黑麦(Secalecereal)、燕麦(Avenasativa)、二穗短柄草、水稻和高粱(Sorghumbicolor)的PHYC蛋白序列。然后利用MEGA-X软件使用Neighbor-joining(NJ)法进行系统进化分析，设置Bootstrap值为1 000。

1.2.2 RNA提取及cDNA合成 采用Trizol试剂盒提取玉米B73叶片的总RNA。RNA样品溶于DEPC水中，然后按照反转录试剂盒说明书反转录得到cDNA，储存于-80 ℃备用。

1.2.3 2个ZmPHYC基因的克隆及载体构建 玉米自交系B73光敏色素ZmPHYC1(Zm00001d034038-T002)和ZmPHYC2(Zm00001d013262-T001)(MaizeGDB，http：//www.maizegdp.org/)的编码区序列(Coding sequence，CDS)扩增引物采用Primer Premier 5.0软件设计，引物序列(ZmPHYC1-F/ZmPHYC1-R和ZmPHYC2-F/ZmPHYC2-R)见表1。扩增ZmPHYC1和ZmPHYC2基因所用的PCR反应体系(20 μL)：7 μL的无菌水，10 μL的2×KOD One酶反应混合液，1 μL的2.5 mmol/L上游、下游引物，1 μL的cDNA。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，35个循环；72 ℃ 2 min；16 ℃保存。反应结束后，将样品从PCR仪中取出，再用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离。电泳结束后，在凝胶成像仪中观察凝胶并拍照，切下目的基因片段，利用无缝克隆试剂盒将其连接到植物表达载体pJIM19-Myc，得到pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2，测序正确后备用。

表1 玉米2个PHYC基因克隆及转基因植株PCR检测引物Tab.1 Primers for cloning two PHYC genes in maize and PCR detection of transgenic plants

1.2.4 拟南芥转化及鉴定 将测序正确的pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2电击转化到农杆菌GV3101中，然后利用浸花法转化到拟南芥野生型Col-0和phyC-2突变体中，得到pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2的T1种子，分别点播在含卡那霉素和除草剂草铵膦(Glufosinate ammonium)的MS培养基中，将T1转基因单拷贝株系(符合孟德尔遗传规律，表现为存活∶死亡=3∶1)幼苗移栽到营养土中并在温室中培养，经过3代筛选得到纯合株系种子用于后续试验。转基因阳性植株的鉴定采用卡那霉素和草铵膦抗性平板筛选结合特异引物PCR检测法，引物序列(ZmPHYC1-PF/ZmPHYC1-PR和ZmPHYC2-PF/ZmPHYC2-PR)见表1。以转基因拟南芥基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增所用的PCR反应体系(总体积为20 μL)：7 μL的无菌水，10 μL的2×KOD One PCR Buffer，1 μL的2.5 mmol/L上游、下游引物，1 μL的DNA。PCR反应程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 2 min；16 ℃保存。反应结束后，将样品从PCR仪中取出，然后用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分离。电泳结束后，用凝胶成像仪观察并拍照。有2 kb条带者即为阳性植株，无此条带者则为阴性植株。

1.2.5 光处理及幼苗下胚轴测定 种子前处理：将拟南芥野生型Col-0、phyC-2突变体和转基因单拷贝纯合株系的种子经消毒灭菌后于4 ℃黑暗放置3 d，点播在1/2 MS培养基平板上，然后置于白光下4 h诱导萌发。光处理：将播种后的1/2 MS培养基平板分别放于黑暗(Dk)、持续远红光[FR，2.50 μmol/(m2·s)]、红光[R,30 μmol/(m2·s)]、蓝光[B，6.0 μmol/(m2·s)]、白光[WL,30 μmol/(m2·s)]22 ℃培养箱中生长4 d。

下胚轴测量：将待测的幼苗摆放在1/2 MS培养基平板上，用体式显微镜(OLYMPUS SZX7)观察并拍照，然后用Image View软件测量幼苗的下胚轴，测量约30株幼苗。

目前，电的使用渗透到生活的方方面面，各行各业都离不开电，随之而来的是更多的供电要求，而配电网起的是分配电能的作用，其直接将电能送给用户[1]，是面向用户的直接传播媒介。网络重构是网络优化的一个有效手段，能够提高供电能力。配电网一般性而言，在闭环系统的时候进行相关的设计工作和解环树状运行[2]，它含有大量的开关，使得重构就是改变网络中开关的断开和闭合，进行网络的重组，以改变网络拓扑结构。配电网重构指的是网络满足辐射树状运行条件下，线路上的容量和电压、电流均符合裕度等一系列约束条件，通过寻优算法寻找该系统的一种开关开闭组合情况，从而实现配电网供电常规目的，如降低网损、消除过载、均衡负荷[3]等。

1.2.6 短日照和长日照处理 按照1.2.4方法将播有野生型Col-0、突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2 MS培养基平板置于短日照条件(Short day，SD，8 h光照/16 h黑暗)或者长日照条件(Long day，LD，16 h光照/8 h黑暗)的22 ℃培养箱中生长6 d，按照1.2.5方法测量下胚轴长度。

1.2.7 避荫处理 种子前处理同1.2.4。避荫处理：将播有野生型Col-0、突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2 MS培养基置于22 ℃白光(R/FR=6.480)培养箱中培养2 d，然后分别在持续白光和白光+远红光 [WL+FR，30 μmol/(m2·s)，R/FR=0.048]的22 ℃培养箱中培养5 d。下胚轴测量同1.2.5方法。

1.2.8 幼苗叶绿素含量测定 将前处理好的播有野生型Col-0、突变体phyC-2和转基因单拷贝纯合株系种子的1/2 MS培养基平板置于持续红光的22 ℃培养箱中生长4 d，每个株系挑取3份，每份150株，置于1.5 mL离心管中，迅速放入-196 ℃液氮中。取出离心管用研磨棒充分研磨，加入300 μL的80%丙酮，黑暗放置2 h，13 200 r/min离心，取250 mL的上清液，加入750 μL的80%丙酮定容，最后用微量分光光度计测量样品A647、A663。根据叶绿素计算公式计算叶绿素含量，叶绿素含量(μg/mL)=18.71×A647+7.15×A663，然后计算每株幼苗的叶绿素含量。

2 结果与分析

2.1 ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的克隆及植物表达载体的构建

以玉米自交系B73的cDNA为模板扩增ZmPHYC1和ZmPHYC2基因片段，然后连接到植物表达载体pJIM19-Myc，经测序验证成功构建了ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的植物表达载体，如图1所示。

2.2 ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白结构域及系统进化分析

通过RT-PCR得到玉米2个ZmPHYC1和ZmPHYC2基因的CDS，二者均为3 405 bp，利用NCBI网站预测其编码1 135个氨基酸残基的多肽，利用ExPASy网站预测二者分子质量分别为126.14 ku和126.07 ku，理论等电点分别为5.89和5.93。利用NCBI网站对ZmPHYC1和ZmPHYC2以及二穗短柄草、水稻和拟南芥的PHYC蛋白结构域进行分析，同时进行多重序列比对分析发现，ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白具有高度保守的结构域，包括1个PAS_2结构域、1个GAF结构域、1个PHY结构域、1个组氨酸激酶A(Histidine kinase A domain，HisKA)结构域和1个类组氨酸激酶ATP(三磷酸腺苷)酶结构域(Histidine kinase like-ATPase domain，HATPase)(图2)。系统进化分析(图3)表明，ZmPHYC1与ZmPHYC2的氨基酸一致性最高(94%)，与高粱的PHYC一致性较高(93%)。禾本科中的普通小麦、黑麦、大麦与水稻的PHYC亲缘关系相对较近，它们与玉米、高粱PHYC蛋白处于不同的分支。

2.3 转基因单拷贝纯合拟南芥株系的筛选

将构建好的pJIM19-Myc-ZmPHYC1和pJIM19-Myc-ZmPHYC2两种重组质粒分别转入拟南芥野生型Col-0和phyC-2突变体，T1转基因株系草铵膦抗性分离比例表现为3∶1，即为单拷贝插入，自交到T3，得到纯合转基因株系。为了确定转基因纯合株系的真实性，利用ZmPHYC1和ZmPHYC2基因特异引物对纯合阳性株系进行PCR鉴定。阳性转基因植株可见2 kb的条带(图4)，而野生型Col-0、phyC-2及阴性植株则无此条带。

2.4 ZmPHYC1和ZmPHYC2基因在拟南芥中的功能验证

2.4.2ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系在持续红光和蓝光下的表型分析 将Col-0、phyC-2、Myc-ZmPHYC1/Col-0(株系#1、#9)、Myc-ZmPHYC2/Col-0(株系#4、#11)分别在黑暗、红光、远红光和蓝光条件下生长4 d，比较各株系的下胚轴长度(图6)。在黑暗、远红光条件下，这些株系幼苗的下胚轴长度没有明显的差异，表明ZmPHYC1和ZmPHYC2对远红光没有明显响应。但在红光条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col-0短31.8%～42.9%和25.8%～34.7%。值得注意的是，phyC-2突变体在蓝光下表型较弱，其下胚轴比野生型伸长10.4%，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系在蓝光条件下下胚轴明显缩短，它们的下胚轴分别比野生型Col-0短36.0～37.8%和26.3～30.7%。并且无论在红光还是蓝光下，ZmPHYC1转基因株系下胚轴均短于ZmPHYC2转基因株系。

2.4.3ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系对短日照和长日照的反应 将Col-0、phyC-2、Myc-ZmPHYC1/Col-0(株系#1、#9)和Myc-ZmPHYC2/Col-0(株系#4、#11)幼苗分别在短日照、长日照条件下生长6 d，然后比较各株系的下胚轴长度(图7)。在短日照条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col-0短41.7%～45.9%和34.4%～35.9%；在长日照条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col-0短26.2%～30.2%和25.7%～27.9%。无论在短日照还是长日照条件下，ZmPHYC1转基因株系下胚轴均比ZmPHYC2转基因株系短；转基因株系下胚轴长度与野生型Col-0的差距在短日照条件下大于长日照条件下。这些结果表明，ZmPHYC1和ZmPHYC2响应长日照和短日照条件，而且对短日照的响应更强烈。另外，在长日照和短日照条件下，与野生型相比，这些转基因拟南芥株系叶柄缩短、叶片肥厚。

2.4.4ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因拟南芥株系对避荫条件的反应 将Col-0、phyC-2、Myc-ZmPHYC1/Col-0(株系#1、#9)和Myc-ZmPHYC2/Col-0(株系#4、#11)幼苗分别在正常白光条件下和在人工模拟遮荫条件下生长，比较各株系的下胚轴长度(图8)。在正常白光条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col-0短14.1%～29.3%和29.1%～34.8%；而在人工模拟遮荫条件下，ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系的下胚轴分别比野生型Col-0短38.8%～46.8%和11.9%～23.8%。在人工模拟遮荫条件下，Myc-ZmPHYC1/Col-0株系#9的下胚轴比Myc-ZmPHYC2/Col-0株系#11短30%。可见，ZmPHYC1比ZmPHYC2可以更强烈地抑制植物的避荫反应。

2.4.5ZmPHYC1和ZmPHYC2转化拟南芥幼苗的叶绿素含量分析 Col-0、phyC-2、Myc-ZmPHYC1/Col-0(株系#1、#9)和Myc-ZmPHYC2/Col-0(株系#4、#11)幼苗在持续红光下生长4 d，转基因株系幼苗的叶绿素含量比野生型Col-0增加45%～57%(图9)，暗示ZmPHYC1和ZmPHYC2可以通过增加叶绿素含量来增强拟南芥幼苗的光合能力。

3 结论与讨论

光敏色素是植物主要的红光与远红光受体，调控植物的光形态建成和避荫性反应等。本研究克隆了玉米的2个PHYC基因，通过系统进化分析和结构域分析，发现玉米PHYC与高粱PHYC进化关系最近，而与麦类和水稻的PHYC进化关系较远。本研究还发现，玉米和高粱的PHYC蛋白聚为一类，小麦、大麦、黑麦、燕麦、二穗短柄草和水稻聚为一类，可见禾本科植物PHYC基因的进化至少有2个分支。ZmPHYC1和ZmPHYC2蛋白与拟南芥、水稻和二穗短柄草对应的PHYC蛋白具有相似的结构域，表明PHYC特定的结构域在进化中是保守的。本研究发现，在持续红光下ZmPHYC1和ZmPHYC2不仅能互补拟南芥phyC-2突变体的表型，而且能显著抑制拟南芥下胚轴伸长。可见，玉米的2个PHYC基因与拟南芥PHYC基因促进红光下的光形态建成的功能类似。

在拟南芥远红光信号途径中，PHYA促进光形态建成，而PHYB以拮抗PHYA的方式来抑制幼苗的去黄化[39-40]。拟南芥PHYC不参与远红光信号途径[33]。拟南芥的PHYA、PHYB和CRY1被认为以功能冗余或者相互叠加的方式参与蓝光信号途径[40-41]。尽管拟南芥phyC突变体对蓝光反应很弱，但是与其他光敏色素一起协同参与蓝光信号途径[32]。ZmPHYC1和ZmPHYC2的过量表达株系，不能响应远红光，却能强烈地响应蓝光处理，因此二者在蓝光信号途径中的作用值得进一步研究。尽管拟南芥phyC突变体在持续的红光下表现出下胚轴伸长和子叶变小，但是与phyB突变体相比，phyB/phyC双突变体的黄化反应的表型未见明显差异，可见拟南芥对红光的反应主要由PHYB介导[33]。近期的研究表明，拟南芥、小麦和水稻等植物中的PHYC均能介导幼苗的去黄化反应和参与植物开花调控[33-37]。然而拟南芥和水稻的PHYC不能形成同源二聚体，需要借助PHYB形成异源二聚体从而介导幼苗光形态建成，但小麦PHYC既能形成异源二聚体，也能形成同源二聚体，在红光下进入细胞核介导光形态建成[30,35,37]。本研究结果表明，ZmPHYC1和ZmPHYC2响应各种光质及光周期处理，推测二者在玉米光形态建成和开花期的调控中起重要作用。

由于植物叶片含有的叶绿素等主要吸收红光，导致透过上层叶片后的光线中，红光与远红光比率下降，下层的植物能感受到这种光照的变化，从而触发避荫性反应，造成植株徒长、茎秆纤细、开花提前、易倒伏。茎秆徒长造成的营养再分配可能导致减产，甚至绝收[13]。近些年来，玉米产量有了较大的提升，其中耐密品种做出了重要贡献[6-8]，目前已选出适合高密植的品种，但绝大部分是增加了对低光的忍耐水平，而非是消除了避荫性[14]。在人工模拟的避荫条件下，过量表达ZmPHYC1和ZmPHYC2的转基因株系均比野生型表现出抑制下胚轴伸长，尤其是ZmPHYC1的转基因株系。可见，ZmPHYC1和ZmPHYC2能参与植物的避荫性调节，ZmPHYC1可能起到更关键的作用。另外，过量表达ZmPHYC1和ZmPHYC2转基因株系在长日照和短日照条件下均能导致叶柄缩短和叶片肥厚，并且可以增加转基因植株的叶绿素含量。可见，研究ZmPHYC基因在密植条件下玉米光信号的避荫反应机制，使玉米株高降低，对培育耐密植、抗倒伏玉米新品种具有重要意义。