响应面法优化罗氏沼虾复合保鲜工艺的研究

杨 丰,沈思远,黄海源,陈露珠,施文正,2,汪之和,2,3

(1 上海海洋大学食品学院;2 国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海);3上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心,上海201306)

罗氏沼虾(Macrobyachium rosenberqii)又称马来西亚大虾、淡水长臂大虾,广泛分布于印度洋、太平洋区域之热带和亚热带地区。近年来,随着水产养殖技术的不断提高,我国罗氏沼虾养殖总产量快速上升[1],2017年中国罗氏沼虾养殖产量为1.374 ×105t,比2016年增长8.51%[2]。罗氏沼虾壳薄体肥、肉质鲜嫩、味道鲜美、营养丰富,因此备受广大消费者青睐。但是由于罗氏沼虾季节性较强且产量大,需要在集中收获期对其进行保鲜,延长货架期,满足各地消费者的需求。

ε-聚赖氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一种天然生物抑菌剂,具有安全性高、热稳定性强以及抑菌谱广等优点[3],在水产品保鲜中广泛运用。侯伟峰等[4]在3—5 ℃条件下用0.1%ε-PL 处理南美白对虾可以延长2—3 d 的货架期。茶多酚(Tea Polyphenols,TP)是一种天然抗氧化剂,主要表现在螯合金属离子、清除活性氧自由基、抑制氧化酶以及促进抗氧化酶活性等方面[5]。熊青等[6]研究表明,茶多酚及其复配生物保鲜剂能有效提高南美白对虾品质。壳聚糖(Chitosan,CS)是由自然界普遍分布的几丁质脱乙酰化处理后制得的天然高分子聚合物,具有良好成膜性,可阻隔细胞内外物质传递[7]。Soyoung 等[8]将2%壳聚糖与聚赖氨酸涂膜用于太平洋白虾,可有效延长保质期至12 d。

目前,对于罗氏沼虾保鲜技术的报道主要是采用冻藏保鲜和气调保鲜等,而保鲜剂的开发应用鲜有报道。本研究考察不同保鲜功能的复合保鲜剂对罗氏沼虾在冷藏(4 ±1)℃的保鲜效果,以期揭示该复合保鲜剂对水产品品质的影响,并通过响应面法优化出高效、低成本、安全的复合保鲜剂配方。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

试验时间为2019年6—8月份。鲜活罗氏沼虾:购于上海市浦东新区果园镇农贸市场,平均体质量(25.00 ±5.00)g,体长(10.00 ±2.00)cm,充氧活运至实验室。三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、氯化钠、硼酸、甲基红、溴甲酚绿、轻质氧化镁、氢氧化钠、高氯酸、氢氧化钾、冰醋酸:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。平板计数琼脂:生化试剂,国药集团化学试剂有限公司。溶菌酶、茶多酚、植酸、壳聚糖、海藻酸钠、普鲁兰多糖:食品级,浙江一诺生物科技有限公司。乳酸链球菌素、ε-聚赖氨酸:食品级,浙江新银象生物工程有限公司。4-己基间苯二酚:食品级,上海瑞祥生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

艾美特SZ3002 真空保鲜机:深圳艾美特科技股份有限公司。SHP-2500 型低温生化培养箱:上海精宏实验设备有限公司。FOSS Kjeltec 8400 型全自动凯氏定氮仪:丹麦FOSS 公司。H2050R 型高速冷冻离心机:长沙湘仪有限公司。UV-1800PC 型紫外-可见分光光度计:上海美谱达仪器有限公司。FE20 型pH计:梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司。DSX-280KB24 型手提式压力蒸汽灭菌器:上海申安医疗器械厂。BCM 型垂直双人标准净化工作台:苏净集团安泰公司。

1.3 试验方法

1.3.1 原料预处理

将鲜活罗氏沼虾浸没在冰水中致其昏死,挑选个体大小一致,虾体完整的罗氏沼虾分别浸渍在保鲜剂溶液中10 min,取出沥干后快速分装聚乙烯保鲜袋,并用封口机封口,放置在(4 ±1)℃生化培养箱中进行保鲜试验,每2 d 取样测定总挥发性盐基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)值、菌落总数以及感官评定等指标。

1.3.2 单一保鲜剂的筛选

分别选取抑菌型保鲜剂(乳酸链球菌素、溶菌酶、ε-聚赖氨酸),抗氧化型保鲜剂(茶多酚、4-己基间苯二酚、植酸),涂膜型保鲜剂(壳聚糖、海藻酸钠、普鲁兰多糖)等9 种不同保鲜剂,分别设置抑菌型保鲜剂浓度为0.1%,抗氧化型保鲜剂浓度为0.1%,涂膜型保鲜剂为1%,除壳聚糖用含1%冰醋酸,其余为无菌蒸馏水配制,对照组(为无菌蒸馏水)。通过TVB-N、TBA 值、菌落总数以及感官评定等指标分别筛选出相对较好的抑菌型、抗氧化型、涂膜型保鲜剂各一种。

1.3.3 单一保鲜剂浓度的筛选

分别设置抑菌型保鲜剂(ε-聚赖氨酸)、抗氧化型保鲜剂(茶多酚)的浓度为0.1%、0.3%、0.5%;涂膜型保鲜剂(壳聚糖)的浓度为1%、2%、3%,其中设置对照组(以无菌蒸馏水处理)。通过TVB-N、TBA 值、菌落总数以及感官评定等指标分别筛选出相对较好的3 种保鲜剂浓度范围。

1.3.4 复合保鲜剂浓度的响应面优化

根据单因素试验的结果,分别选择ε-聚赖氨酸、茶多酚、壳聚糖不同的质量分数浓度,采用三因素三水平的响应面分析法(表1)。以TVB-N 作为响应值,筛选出最佳配比的复合保鲜剂并进行验证试验。

表1 响应面试验因素水平编码Table 1 Factors and levels in response surface experiment

1.3.5 响应面优化复合保鲜剂验证试验

将预处理后的罗氏沼虾经过不同处理后随机分为5 组进行分装:1)试验组:响应面试验的复合保鲜剂组合;2)0.3% ε-聚赖氨酸保鲜对照组;3)0.3%茶多酚保鲜对照组;4)2.3%壳聚糖保鲜对照组;5)对照组:未经任何处理的样品。分别置于(4 ±1)℃生化培养箱中贮藏,货架期内测定其TVB-N、TBA、菌落总数、肌肉pH 并进行感官评定,从而研究复合保鲜剂对罗氏沼虾的保鲜效果。

1.3.6 保鲜指标的测定

1.3.6.1 挥发性盐基氮(TVB-N)

根据标准GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》[9]。

1.3.6.2 硫代巴比妥酸(TBA)值

参考杨阳[10]和马海建等[11]的方法,准确称取虾肉样品5.00 g,加入25 mL 的20%三氯乙酸溶液和20 mL蒸馏水,匀浆并静置1 h 后冷冻离心10 min(4 ℃,8000 r∕min),取上清液过滤后定容至50 mL,取5 mL的滤液加入0.02 mol∕L 硫代巴比妥酸溶液5 mL,沸水浴中反应20 min,取出后流水冷却5 min,于532 nm 处测吸光度A。以蒸馏水为空白样,平行测定3 次,取平均值。TBA 值=A×7.8 mg∕(100 g)。

1.3.6.3 菌落总数

根据标准GB 4789.2—2016《食品卫生微生物检验 菌落总数测定》[12]。

1.3.6.4 肌肉pH

取虾肉2 g,加入18 mL 蒸馏水,匀浆2 min,静置30 min 后取上清液,采用pH 计测定。

1.3.6.5 感官评价

感官评定由10 名有感官评定经验的人员组成,总分6 分以下表示虾已不可食用。罗氏沼虾感官评分标准见表2。

表2 罗氏沼虾综合感官评分Table 2 Sensory evaluation of Macrobrachium rosenbergii

1.4 数据处理

使用SPSS 24.0 软件对试验结果进行分析,在单因素方差分析(ANOVA)的基础上采用最小极差法(LSD)进行组间比较,取P＜0.05 为差异显著,利用Origin 9.1 软件作图。

2 结果与分析

2.1 单一保鲜剂筛选

2.1.1 3 种抑菌型保鲜剂筛选

如图1 所示,TVB-N、菌落总数随贮藏时间的延长总体上升,感官评分逐渐下降,抑菌组明显好于对照组。在保鲜第4 天时,对照组的TVB-N 值已超过20 mg∕(100 g),0.1%乳酸链球菌素和0.1%溶菌酶组在保鲜第6 天时已腐败,而0.1%ε-聚赖氨酸组在第8 天的TVB-N 值为19.83 mg∕(100 g);0.1%乳酸链球菌素和0.1%溶菌酶组的菌落总数在贮藏8 d 内均高于0.1%ε-聚赖氨酸组,三种保鲜剂的菌落总数均呈先下降后上升趋势,可能是虾体本身所携带的细菌受低温和抑菌保鲜剂双重抑制,生长出现延滞期,而后随着贮藏时间延长,细菌逐渐适应了环境,虾体表面的保鲜剂逐渐渗透细胞内,导致虾体表剩余保鲜剂的量越来越少,使耐冷微生物不断繁殖,以致菌落总数逐渐上升[13-14];当感官评分低于6 分时表示消费者已无法接受,在保鲜6 d 时,只有0.1%ε-聚赖氨酸组依然高于6 分。通过TVB-N、菌落总数、感官评价综合表明抑菌型保鲜剂中的ε-聚赖氨酸处理罗氏沼虾的保鲜效果较好。

图1 不同抑菌型保鲜剂对罗氏沼虾菌落总数、TVB-N 和感官评分的变化Fig.1 Changes of total bacteria counts,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different bacteriostatic preservative

2.1.2 3 种抗氧化型保鲜剂筛选

如图2 所示,三种抗氧化型保鲜剂的TBA 值均明显低于对照组,说明它们均能有效抑制虾肉的脂肪氧化,其中茶多酚组抗氧化效果相对较好,且其第6 天时的TVB-N 值仍然低于20 mg∕(100 g);根据感官评分显示茶多酚组对于消费者的可接受程度更高。因此选择茶多酚进行后续试验。

图2 不同抗氧化型保鲜剂对罗氏沼虾TBA、TVB-N 和感官评分的变化Fig.2 Changes of TBA,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different antioxidant preservative

2.1.3 3种涂膜型保鲜剂的筛选

图3 不同涂膜型保鲜剂对罗氏沼虾TVB-N、菌落总数和感官评分的变化Fig.3 Changes of TVB-N,total bacteria counts and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different coating preservative

如图3 显示,壳聚糖组的TVB-N 值和菌落总数均低于其他两种涂膜型保鲜剂组,但是在保鲜初期(0—4 d),壳聚糖组的感官评分低于其他两组,主要原因是配制壳聚糖保鲜剂时加入了1%冰醋酸,在保鲜中后期,壳聚糖组较优。

2.2 单一保鲜剂浓度的筛选

2.2.1 ε-聚赖氨酸浓度的筛选

图4 分别显示不同浓度的ε-聚赖氨酸的保鲜效果,0.3%ε-聚赖氨酸的TVB-N 值最优;当质量浓度达到0.5%时新鲜度下降及菌落总数上升,可能是由于ε-PL 分解产生的L-赖氨酸为细菌的生长提供了营养物质,促进了细菌的生长,所以细菌总数反而有所增加[15];0.1%ε-聚赖氨酸因为浓度较低,感官评分在保鲜2—4 d 时相比0.5%ε-聚赖氨酸明显下降,而后两个浓度之间差异不大,0.3%ε-聚赖氨酸的感官评分在贮藏8 d 内均最高。因此选择0.2%—0.4%作为ε-聚赖氨酸的适宜保鲜浓度范围。

图4 不同浓度的ε-聚赖氨酸对罗氏沼虾菌落总数、TVB-N 和感官评分的变化Fig.4 Changes of total bacteria counts,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of ε-PL

2.2.2 茶多酚浓度的筛选

由图5 可知,0.3%质量浓度的茶多酚处理罗氏沼虾的抗氧化性和保鲜效果最优,TBA 值随着保鲜时间总体呈上升趋势,并且均显著低于其他浓度组;TVB-N 值表明0.3%茶多酚组的货架期可达8 d;另外高浓度的茶多酚会使虾体的表面色泽变黄,影响消费者的可接受程度。因此选择0.2%—0.4%作为茶多酚的适宜保鲜浓度范围。

图5 不同浓度的茶多酚对罗氏沼虾TBA、TVB-N 和感官评分的变化Fig.5 Changes of TBA,TVB-N and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of TP

2.2.3 壳聚糖浓度的筛选

如图6 所示,随着壳聚糖质量浓度的增加,保鲜和抑菌效果越好,而感官评分中3%壳聚糖保鲜组低于2%壳聚糖保鲜组,可能是高浓度的壳聚糖不易溶解,并且非常黏稠,不易形成干燥的薄膜,且因加入了冰醋酸,有较强的酸味,因此选择1.5%—2.5%作为壳聚糖的适宜保鲜浓度。

2.3 响应面优化试验结果

利用Design-Expert 10.0 软件对表3 的数据进行回归拟合,得到TVB-N 值对ε-聚赖氨酸浓度、茶多酚浓度、壳聚糖浓度三个因素的二次多项回归方程模型为:

式中:Y为TVB-N值;A为ε-聚赖氨酸浓度;B为茶多酚浓度;C为壳聚糖浓度。

图6 不同浓度的壳聚糖对罗氏沼虾TVB-N、菌落总数和感官评分的变化Fig.6 Changes of TVB-N,total bacteria counts and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different concentrations of CS

表3 响应面试验方案及结果Table 3 Program and test result of response surface experiment

表4 回归模型的方差分析Table 4 The variance analysis of regression model

回归模型的方差分析见表4。表4 显示该模型的F值为357.52,P＜0.0001,说明该模型是极显著的;失拟项的P值为0.5224(P＞0.05),表示不显著,R2=0.9978,说明该模型是可靠的,拟合程度较好;另外一次项A、B、C 的回归系数均极显著,说明ε-聚赖氨酸浓度、茶多酚浓度、壳聚糖浓度三个因素对罗氏沼虾TVB-N 值有很强的影响作用;交互项中AB、AC、BC 达到极显著水平(P＜0.01);根据一次项的F值,可知各试验因素对响应值TVB-N 值的影响强弱顺序为:ε-聚赖氨酸浓度＞壳聚糖浓度＞茶多酚浓度。综上说明,该试验设计是可靠的并且可以用来预测各种因素对TVB-N 的影响。

图7 是各因素交互作用对TVB-N 值的影响的响应面3D 图,响应面图的等高线为椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则表示不显著[16-17]。响应面图的等高线均为椭圆形,各因素相互作用显著。

图7 ε-聚赖氨酸、茶多酚和壳聚糖浓度的交互作用影响TVB-N 的响应面3D 示意Fig.7 Interaction of ε-PL,TP and CS concentrations effect TVB-N of response surface 3D diagram

2.4 最优工艺参数及验证试验

根据Design-Expert 10.0 软件分析和数据优化,得到最优工艺条件:ε-聚赖氨酸浓度为0.32%、茶多酚浓度为0.33%、壳聚糖浓度为2.26%;根据实际可操作性,将其修正为:ε-聚赖氨酸浓度为0.3%、茶多酚浓度为0.3%、壳聚糖浓度为2.3%;通过3 次验证试验,保鲜第8 天的TVB-N 值达到18.06 mg∕(100 g),接近预测值,表明响应面法优化罗氏沼虾复合保鲜工艺是稳定可行的。

2.5 复合保鲜剂对罗氏沼虾保鲜效果的影响

图8 不同保鲜处理对罗氏沼虾pH、TVB-N、菌落总数、TBA 和感官评分变化Fig.8 Changes of pH,TVB-N,total bacteria counts,TBA and sensory evaluation of Macrobyachium rosenberqii by different preservation groups

如图8(a)表示不同保鲜处理组对罗氏沼虾pH 的变化,pH 是评判虾体肉质优劣与其新鲜度的关键指标之一[15,18]。在冷藏保鲜过程中,虾体在自身酶和微生物的作用下,产生大量氨、三甲胺、吲哚、组胺等碱性物质[19]。有研究表明,pH 在7.6 以上则认为是消费者不可接受的值[19-21]。最优试验组在保鲜过程中pH 明显低于单一保鲜剂组和空白对照组,表明复合保鲜剂处理罗氏沼虾可有效防止虾体自溶腐败。

图8(b,c)中几种不同处理的TVB-N 值和细菌总数均呈持续上升趋势,最优试验组明显上升幅度更平缓,保鲜第10 d 时的TVB-N 值仅为20.57 mg∕(100 g)。通常根据淡水鱼、虾中挥发性盐基氮的可接受值低于20 mg∕(100 g)[22]。最优试验组能有效减缓细菌的繁殖速度,说明复合保鲜剂组具有一定的抑菌作用,有效降低细菌对蛋白质的分解,从而达到延缓TVB-N 上升的作用[21]。

图8(d)可以看出在保鲜过程中,复合保鲜剂组＜0.3%茶多酚＜2.3%壳聚糖＜0.3%ε-聚赖氨酸,茶多酚具有较强抗氧化性,而壳聚糖由于在虾体表面形成一层薄膜,一定程度上隔绝虾体与外界的氧气,因此复合保鲜均协同发挥作用,延缓脂肪氧化,延长虾体货架期。

图8(e)中的感官评分也反映虾体相同的新鲜程度,虽然复合保鲜剂组的评分并未达到预期,主要因为壳聚糖涂膜造成的虾体表面粘连感以及茶多酚作用后导致的色泽黄暗,嗅觉上仍残留少许醋酸和壳聚糖的混合固有气味,在一定程度上影响消费者的可接受程度,需要后续进一步对保鲜机制的探究,从而达到更好的保鲜效果。

3 结论

采用Box-Behnken 的中心组合设计响应面法建立ε-聚赖氨酸浓度、茶多酚浓度、壳聚糖浓度与TVB-N值之间的响应面数学模型,确定了罗氏沼虾利用ε-聚赖氨酸、茶多酚、壳聚糖复配保鲜剂冷藏(4 ±1)℃保鲜的工艺参数为:ε-聚赖氨酸浓度为0.3%、茶多酚浓度为0.3%、壳聚糖浓度为2.3%;罗氏保鲜8 d 后TVB-N 值为18.06 mg∕(100 g),回归分析和验证试验表明了该响应面法具有可行性。在此条件下,罗氏沼虾冷藏10 d 期间,TVB-N 值、TBA 值、菌落总数、pH 以及感官评分的最优保鲜试验组均显著优于单一保鲜剂组以及空白对照组,变化趋势保持一致。这表明ε-聚赖氨酸、茶多酚与壳聚糖复配保鲜剂可减缓罗氏沼虾的腐败变质,延长货架期至9—10 d。