非洲猪瘟病毒微芯片荧光PCR快速检测技术的建立及初步应用

刘 洋，王新杰，汪葆玥，李 翔，高姗姗，马 静，孙晓明，王传彬，倪建强*

(1.中国动物疫病预防控制中心，北京 102618；2.北京亿森宝生物科技有限公司，北京 100025；3.中国牧工商集团有限公司，北京 100070)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起猪的一种急性、热性、高度致死性传染病。该病病程短，死亡率高，被世界动物卫生组织(OIE)列为法定通报的动物疫病[1]，我国也将其列为一类动物疫病[2]。2018年8月，我国首次发生ASF疫情。之后该病迅速蔓延扩散，截止2019年12月，除澳门、台湾外，我国大陆所有32个省级行政区均已发生ASF疫情，全国范围内累计扑杀生猪超过100万头，直接和间接损失巨大。同时，ASF在亚洲也持续蔓延扩散，在蒙古、越南、柬埔寨、朝鲜、老挝、缅甸、菲律宾、韩国和东帝汶等多个国家相继暴发疫情，ASF防控面临严峻的国际形势。

目前，世界范围内尚未研制成功安全有效的ASF疫苗，其防控主要依赖于及时、准确的病原检测和消灭传染源[3-10]。为此，我国农业农村部要求，在ASF防控期间，除养殖场外，全国生猪屠宰及生猪产品流通等环节要全面开展检测。我国《非洲猪瘟防治技术规范(试行)》中推荐了3种ASFV病原检测方法，包括双抗体夹心酶联免疫吸附试验、聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光聚合酶链式反应(荧光PCR)[3]，其中荧光PCR技术因其敏感性高、特异性强且自动化程度高，被OIE、FAO和我国相继推荐用于ASF的检测[1]。但常规荧光PCR普遍存在核酸提取过程复杂，检测用时较长等缺陷，导致检测效率低下，不能满足于现场快速检测的需求。为此，本研究结合样本处理液进行全血样本及组织样本的快速前处理，建立了免提取微芯片荧光PCR，检测用时仅为30 min，且简化了检测步骤，使荧光PCR成为适合于屠宰场、养殖场和流通环节ASF检测的技术，为疫情处置争取了时间。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器GoTaq hot start polymerase、High Pure dNTPs、MgCl2和10×Buffer均购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司；DNase/RNase-Free去离子水、质粒小提试剂盒和磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；矿物油购自索莱宝生物技术有限公司；30孔微芯片购自加拿大鲁美科思仪器设备有限公司。TISSUELYSER Ⅱ组织研磨仪由Qiagen 生产；SCIENTIFIC KINGFISHER自动化核酸提取仪由THERMO生产；ABI 7500 fast荧光PCR仪由Life公司生产；微量芯片荧光PCR仪由北京亿森宝科技有限公司生产。

1.2 样品猪瘟病毒(CFSV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)来源于市售弱毒活疫苗；猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)和猪伪狂犬病病毒(PRV)由中国动物疫病预防控制中心兽医诊断室分离保存。临床样品来自不同省份送检的疑似临床病料，包括66份猪全血和51份猪组织样品，共计117份。

1.3 样品处理液配制按照如下比例配制样品处理液：Tris-HCl终浓度100 mmol/L，NaCl终浓度1.4 mol/L，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，NP-40终浓度1%。

1.4 重组质粒的构建参照GenBank中ASFV Georgia 2007毒株B646L基因序列，合成全基因片段，由华大基因合成并克隆于pUC-57载体，获得重组质粒(命名为pUC-57-B646L)及其转化菌，质粒经提取后溶于TE溶液(10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA pH 8.0)，测定D260和D280值，计算质量浓度。

1.5 引物及探针的设计参照GenBank中ASFV的24个亚型，经DNAMAN6.0软件对其B646L基因部分序列进行比对，在其保守区域设计引物与TaqMan探针(ASFV-F、ASFV-R及ASFV-Probe)，序列见表1，均由华大基因合成。

1.6 临床样品的处理将临床采集的样品处理液作为微芯片荧光待检物，具体处理方法为组织样品匀浆后取100 μL加入150 μL样品处理液，离心1 min，取上清备用；全血样品取20 μL加入780 μL样品处理液，混合均匀，取混合液备用。同时，采用磁珠法病毒DNA/RNA 提取试剂盒提取临床采集样品的核酸，用于OIE推荐荧光PCR方法的检测。

1.7 微芯片荧光PCR反应体系的优化采用方阵法对反应体系的引物和探针终浓度(0.1,0.2,0.3,0.4 μmol/L)、Mg2+终浓度(0.5,1.0,1.5,2.0 mmol/L)、GoTaq hot start polymerase终浓度(0.1,0.2，0.3，0.4,0.5 U/μL)等进行优化。根据方阵法筛选出来的最优引物、探针、Mg2+和Gotaq hot start polymerase终浓度配制反应液，模板核酸DNA体积和体系总体积分别按比例1∶2.5,1∶2.0,1∶1.5,1∶1,1∶0.5加入，其余用无核酸酶水分别补足至1.2 μL。根据检测结果选择最优微芯片规格以及模板核酸DNA体积。

表1 引物及探针序列

1.8 微芯片荧光PCR反应条件的优化反应条件第一步，预变性为95℃，时间分别为1,3,5,10 min；第二步循环次数分别为35,40,45个循环，变性温度为95℃，时间分别为3,5,10,15 s；随后进行退火及延伸温度为55℃和60℃，时间分别为15,30,45,60 s，并在此步骤收集荧光信号。

1.9 OIE推荐荧光PCR反应体系及反应条件参照《OIE陆生动物诊断与疫苗手册》中ASF荧光PCR检测方法进行扩增，引物及探针序列见表1，反应体系见表2。在ABI 7500 fast荧光PCR仪上进行以下反应，反应程序：预变性，95℃ 10 min，1个循环；荧光PCR扩增 95℃ 15 s，58℃ 1 min，40个循环。在58℃ 延伸时收集荧光信号。报告基团：设置为FAM。淬灭基团：NONE。试验结束后，根据收集的Ct值和荧光曲线判定结果。

表2 OIE荧光PCR检测试剂反应体系

1.10 微芯片荧光PCR反应特异性分别提取CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV基因组核酸，用已建立的ASFV微芯片荧光PCR方法分别对其进行检测，以无核酸酶灭菌水作为阴性对照，以含有重组质粒pUC-57-B646L的TE溶液为阳性对照，分析评估该方法的特异性。

1.11 微芯片荧光PCR反应灵敏性将含有质粒pUC-57-B646L的TE原液(浓度为1012拷贝/μL)，用无核酸酶水稀释成10-6,10-7,10-8,10-9,10-10,10-11,10-12共7个稀释度，使用ASF微芯片荧光PCR最优体系及反应条件进行检测，同时用同样稀释的相同模板进行OIE推荐的荧光PCR方法平行检测，以确定和比较两种检测方法的灵敏性。

1.12 微芯片荧光PCR反应重复性利用本研究所建立的方法初步组装成试剂盒，选用同一批次的3个试剂盒对8份ASFV阳性样品和8份阴性样品进行检测，评价其批内重复性；选用3个不同批次的试剂盒对同样8份阳性和8份阴性样品进行检测，评价其批间重复性。

1.13 临床样品的检测将采自不同地区的全血和组织样品按照1.6方法处理，利用本研究所建立的微芯片荧光PCR进行检测。同时，提取样品总DNA 为模板，利用OIE推荐的荧光PCR方法进行检测，并对结果进行比较分析。

2 结果

2.1 ASFV微芯片荧光PCR的建立经过对微芯片荧光PCR方法进行优化，最终确定反应体系为1.2 μL，引物、探针终浓度为0.2 μmol/L，Mg2+终浓度为1.5 mmol/L，Gotaq hot start polymerase终浓度为0.3 U/μL；模板核酸DNA体积和体系总比例为1∶1，每个反应加入量0.6 μL。反应最佳条件：95℃ 3 min，1个循环；95℃ 5 s，60℃ 30 s，在此步骤收集荧光信号，共40个循环。

2.2 微芯片荧光PCR特异性特异性试验结果显示，ASF微芯片荧光PCR方法除阳性对照出现特异性扩增曲线以外，对CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV等的基因组核酸均呈阴性，说明该方法特异性良好。

2.3 微芯片荧光PCR灵敏性灵敏性试验结果表明(表3)，ASF微芯片荧光PCR方法的最低检测浓度为10拷贝/μL，Ct值为37.12，而OIE推荐的荧光PCR方法的最低检测限为102拷贝/μL。上述结果表明微芯片荧光PCR方法的灵敏度优于OIE推荐的荧光PCR方法。

2.4 微芯片荧光PCR重复性利用所建立的方法进行批内和批间重复性检测，结果显示，阴性样品检测均为阴性，阳性样品的批内(0.14%～0.54%)及批间(0.04%～1.37%)变异系数均<2%(表4)，表明该试剂盒具有较好的重复性。

2.5 微芯片荧光PCR方法的应用将117份临床样品经快速提取，所得的核酸粗提物利用所建的微芯片荧光PCR方法进行检测，结果显示，共检出阳性样品40份，阴性样品77份。上述结果与采用商品化核酸提取试剂盒经OIE推荐的ASFV荧光PCR方法检测结果完全一致，结果见表5，两种方法的总符合率为100%。

表3 ASFV微芯片荧光PCR灵敏度检测结果

表4 阳性样品批内及批间重复性检测结果

表5 临床样品检测结果

3 讨论

自2018年我国首次发生ASF，一年半的时间里该病传播到我国除澳门、台湾外所有省级行政区划，给我国养猪业造成了深远的影响[8-10]。据国家统计局2019年11月9日公布的数据显示，2019年10月，猪肉价格上涨101.3%，影响当月全国居民消费价格(CPI)上涨达到64%[4]。为此，国务院办公厅出台《关于加强非洲猪瘟防控工作的意见》(国办发[2019]31号)文件，“鼓励养猪场(户)自行开展非洲猪瘟检测，及早发现和处置隐患”，“督促指导生猪屠宰厂(场)落实各项防控措施，配齐非洲猪瘟检测仪器设备，按照批批检、全覆盖原则，全面开展非洲猪瘟检测，切实做好疫情排查和报告”。鉴于屠宰场开展检测所面临的不同于常规实验室检测的特殊工作环境，检测的快速、准确就显得尤为重要[11]。

为满足我国ASF病原检测的需求，研究人员相继建立了多种核酸检测技术，如杨吉飞等[12]、王彩霞等[13]建立了ASFV环介导恒温扩增(LAMP)快速检测技术，可以将反应时间控制在30～60 min，灵敏度为10拷贝质粒DNA[7]或2 fg重组质粒[12]。林彦星等[14]建立了荧光RPA快速检测方法，可以将反应控制在15 min完成，灵敏度为20 copies/μL。GAO等[15]建立了一种交叉引物扩增-试纸条方法，用于快速现地检测ASFV，最低检测限为200拷贝，与荧光定量PCR的符合率为97.8%。这些方法是ASFV检测的重要探索，且在诊断中发挥了重要作用。但是，在检测技术的接受程度、产品应用范围等方面，荧光PCR技术仍是ASFV最主要的确诊技术。

本研究设计合成了ASFVB646L基因特异性引物和TaqMan探针，建立了基于微芯片这一反应载体的荧光PCR技术，同时结合样品处理液快速提取核酸，在保证检测结果准确的基础上，大大缩短了检测所需时间。应用本研究所建立的方法，对CFSV、PRRSV、PCV1、PCV2、PRV和PPV等6种常见猪病病毒进行检测，结果显示均为阴性，无任何特异性扩增曲线，说明该方法特异性良好。且该方法最低可检测到1×101拷贝/μL的ASFV，比OIE推荐的荧光PCR反应灵敏10倍。批内、批间重复性检测的变异系数低于2%，说明该方法重复性良好。通过对包括40份ASF阳性临床样品在内的117份猪临床样品(包括全血和组织)经快速提取后进行微芯片荧光PCR检测，结果与商品化试剂盒提取核酸后经OIE推荐的荧光PCR方法结果完全一致，说明本方法完全适用于ASFV的临床检测。另外，本研究中建立的荧光PCR方法，与常规方法相比，反应体积仅1.2 μL，在节省反应成本的同时缩短升降温所需时间，仅需30 min即可完成反应。而且反应室的芯片不同于普通塑料反应管，温控更好，体系内温度更为均匀，有利于反应的充分进行。

ASFV微芯片荧光PCR建立之后，组装了试剂盒，参与并获得农业农村部第一批ASF现场快速检测试剂的推荐。临床应用证实，微芯片荧光PCR方法特异、敏感、简便、经济、快速，对于屠宰场或其他需要对ASF开展快速检测的工作场所具有重要的意义。