重组酶聚合酶扩增技术在人偏肺病毒快速诊断的方法建立与临床评价*

唐 娟 刘文毅 刘 霄

广东省深圳市宝安区松岗人民医院检验科中心实验室 518105

在临床上，急性呼吸道感染是目前国内外导致急性病以及致死性疾病的重要病因之一，传统的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒、副流感病毒、流感病毒和腺病毒等，但仍有1/3的感染病原尚未完全明确[1-2]。人偏肺病毒(hMPV)最早是由荷兰学者Van De Hoogen等人在2001年从呼吸道感染婴幼儿的标本中分离获取，且近年来在全球范围内多个国家均有陆续报道，提示了其呈全球流行，可能是社区获得性呼吸道感染较为常见的一种病原体[3-4]。相关研究报道显示，hMPV感染会导致上呼吸道或(和)下呼吸道感染，患者主要临床表现包括咳嗽、咳痰、喘息、流涕、头痛、乏力和发热等，部分患者出现低氧血症[5-6]。然而，hMPV感染患者尚且缺乏明显的特异性临床表现，难以依靠临床症状与其他呼吸道病毒感染进行鉴别区分，从而增加了临床诊断的难度以及病毒传播的速度。由此可见，建立病原体核酸快速诊断平台显得尤为重要，亦是目前国内医疗机构亟待解决的问题之一。病毒核酸检测的本质是对病毒RNA基因组进行检测，如RT-PCR、基因芯片、等温扩增技术、核酸质谱技术以及病毒基因组测序等[7]。重组酶聚合酶扩增(RPA)属于等温扩增技术之一，即在固定的温度条件下即可实现核酸的快速扩增，反应过程无需温控循环系统，整个过程在10～30min内即可完成[8]。鉴于此，本文通过研究重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断的方法建立与临床价值，旨在为hMPV的诊治提供一种科学的检测手段，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 将2017年1月—2019年12月医院收治的急性呼吸道感染患儿200例纳入研究。年龄1～10岁，平均年龄(5.22±1.30)岁；男121例，女79例。入选标准：(1)均因急性呼吸道感染入院接受治疗；(2)入院前尚未接受任何相关治疗；(3)无临床病历资料缺失。剔除标准：(1)心、肝、肾等重要脏器发生严重病变者；(2)研究过程中因各种原因退出或失访者；(3)正参与其他研究者。研究对象父母均签署知情同意书，且本次研究获得医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法 (1)重组酶聚合酶扩增技术快速诊断hMPV的方法建立：团队前期通过检索Genbank数据库，检索hMPV株基因序列，数据库已公布了hMPV检测用相关基因位点、引物及探针等序列信息和文献报道的信息，针对靶向特定区域设计出引物和荧光探针，并进一步在线BLAST比对验证，没有在其他病毒中发现此靶向区域。随后通过使用病毒株(逆转录病毒和噬菌体的生物学特性开发出模拟原病毒的假病毒或质粒)和临床不同类型阴性标本对此方法学的最低检测限、包容性、分析特异性和精密度进行临床评价，并验证其对临床不同类型样本在使用化学释放法制备所引进物质的干扰试验。应用生物信息学软件通过靶向特定区域，对hMPV的N基因和L基因2个位点进行检测，并设计引物及荧光探针。使用病毒株和阴性对照品对基于重组酶聚合酶扩增技术快速检测hMPV的方法进行性能评估。进一步验证并优化临床不同类型样本微量核酸释放法联合重组酶聚合酶扩增技术检测方案。(2)直接荧光免疫法检测：具体操作严格参照参考文献[9]：即由护士采集鼻咽分泌物，负压吸取1～2ml的分泌物至无菌的生理盐水溶液吸瓶内，无痰者则在雾化后吸引，待标本采集成功后于2h内送检。首先以毛细吸管对标本进行反复吹打，移至尖底离心管中以1 000～1 500r/min条件进行时长5～10min的离心处理，去除上清液，留沉淀。加入5ml的PBS溶液进行洗涤，剧烈混匀10～15s，再次按照上述离心条件进行离心处理，将上清液和沉淀上的黏液层去除，避免搅乱细胞沉淀，重复洗涤5次左右，直至沉淀上的黏液层彻底除去，最后留取0.5～1ml的细胞悬液，于样片上点样，每点加入25μl的细胞悬液，待其自然干燥后，以冷丙酮进行时长为10min的固定处理，风干。随后选择样本片或对照片的每个细胞点加入相应的荧光抗体，在37℃温盒中孵育30min，以洗涤液洗涤后加入1滴封闭液，封片后于荧光显微镜下观察结果。诊断阳性标准如下：荧光显微镜下观察可见细胞内出现苹果绿色荧光，且200倍显微镜下任一视野找到2个及2个以上荧光细胞。

1.3 观察指标 比较两种检测方式的诊断效能，分析hMPV感染患者合并其他病毒感染情况。

2 结果

2.1 两种检测方式的诊断效能评价 以RT-PCR检测结果为金标准，重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度分别为97.56%、98.74%、98.50%，均明显高于直接荧光免疫法检测的85.37%、93.71%、92.00%(均P<0.05)。见表1～2。

表1 两种检测方式的诊断结果评价

表2 两种检测方式的诊断灵敏度、特异度、准确度评价(%)

2.2 hMPV感染患者合并其他病毒感染情况分析 hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83%，其中主要涵盖冠状病毒9.76%、呼吸道合胞病毒7.32%、流感病毒4.88%等。见表3。

表3 41例hMPV感染患者合并其他病毒感染情况分析

3 讨论

在临床上，hMPV的流行病学包括以下几点特征[10-12]：(1)明显的季节性，即多发于冬春季节；(2)可感染不同年龄阶段人群，且以5岁以下儿童以及老年人群为主；(3)hMPV病毒可单独感染易感人群，亦可和其他呼吸道病毒发生混合感染；(4)hMPV已遍布全球。随着近年来相关研究的日益深入，不少学者提出对所有年龄阶段的呼吸道疾病患者实施hMPV病毒检测，从而抑制病毒的传播速度[13-14]。然而，因国家药品监督管理局体外诊断试剂目录尚无hMPV核酸检测试剂盒，从而使得临床医疗机构无法开展hMPV核酸检测服务，仅有少数的科研机构可开展相关检测服务，特别是在新型冠状病毒防控时期，对急性传染病病原学鉴别诊断造成了一定的难度，因此，寻找一种积极有效的病原体核酸快速诊断方式具有极其重要的意义。重组酶聚合酶扩增技术是近年来所开发的一种有望替代PCR的新型核酸扩增技术，其主要基于重组酶聚合酶介导的扩增原理，体外模拟生物体内DNA复制，于恒温条件下即可对目的片段实施扩增，尤其适用于多种病原的快速检测中[15-17]。

重组酶聚合酶扩增技术主要依赖可结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白以及链置换DNA酶，上述三种酶的混合物于常温状态下亦有一定活性，且最佳反应温度为37℃左右，反应过程中无需模板链的预变性，可在恒定低温条件下10～20min内快速扩增目的DNA或RNA[18-19]。相较于传统聚合酶链式反应而言，重组酶聚合酶扩增技术具有反应温度恒定、扩增速度快、检测成本低、使用仪器简单以及结果可靠等优势，尤其适用于现场快速检测，对急需诊断结果的患者而言意义十分重大。本研究发现，以RT-PCR检测结果为金标准，重组酶聚合酶扩增技术诊断hMPV的灵敏度、特异度、准确度均明显高于直接荧光免疫法检测。分析原因，笔者认为重组酶聚合酶扩增技术对检测设备的要求较低，甚至可通过人体体温完成对样品的检测，同时对检测样品要求较低，仅需采用简单的裂解液裂解60s便可作为模板，尤其适用于实地检测。与此同时，该技术的特异性较佳，且灵敏度较高，可和RT-PCR相媲美。临床体会，重组酶聚合酶扩增技术除了灵敏度、特异度较高以及适用于现场样品检测后，还具备以下几点优势：(1)可实现多重反应，同时并快速地检测多重样品；(2)反应速度迅速，往往在5～20min内便可完成检测，在速度方面展现出来的优势远远优于PCR以及HDA等技术；(3)操作简便，且能和多种检测方式相结合，继而提高临床诊断价值；(4)检测过程中有效减少所需能力以及成本，利于推广应用。然而，重组酶聚合酶扩增技术仍存在一定的不足之处：如相关产物在琼脂糖凝胶电泳检测过程中，必须对产物实施纯化，从而避免产物之外的其他成分对检测结果造成的影响；反应温度在37℃左右，且反应时间较短，在对大量样品进行同时检测过程中，不易控制反应的同时进行；迄今为止尚无专门的软件对重组酶聚合酶扩增技术引物以及探针实施设计和筛选。另外，hMPV感染患者合并其他病毒感染发生率为26.83%，这提示了部分hMPV感染患者往往合并其他病毒感染，从而可能增加临床治疗难度，应予以重视。然而，蔡勇等人的一项研究报道表明[20]：223例hMPV阳性患儿同时检出其他病毒感染人数42例，占比18.83%，明显低于本研究结果。而导致两项研究发生差异的主要原因可能和研究样本量以及年龄阶段不同有关，值得临床关注。

综上所述，重组酶聚合酶扩增技术在hMPV快速诊断中的应用价值较高，可获得较为理想的灵敏度、特异度以及准确度，有望成为替代传统PCR的有效检测方式，值得临床推广应用。然而，该技术尚且存在一定的不足之处，有待今后的持续改进。