笃斯越桔组织培养体系的建立

常 婧， 程彦博

(1.辽宁省森林经营研究所，辽宁 丹东 118002；2.辽宁省林业发展服务中心，辽宁 沈阳 110036)

笃斯越桔，又称越桔、蓝浆果，为多年生落叶或常绿灌木[1]。我国笃斯越桔大多分布在东北三省以及内蒙古地区[2]。近年来，因笃斯越桔果实含丰富氨基酸、矿质元素以及花青甙，低糖、低脂肪，抗氧化能力强，鲜美可口，无污染，深受人们的青睐[3]。笃斯越桔属于野生酸性植物，果实小不易采摘，且产量不稳定，导致笃斯越桔资源的稀缺，在市场上出现了供不应求的现象[4]。工厂化育苗是快速增加笃斯越桔资源的途径之一。近年来，随着微体快繁技术的迅速发展，笃斯越桔的组织培养有了一定的研究基础，如外植体、培养基的筛选，激素种类及质量浓度的确定等，但是缺乏系统化的研究[5-9]。为此本论文建立了完善的笃斯越桔组织培养体系，可为笃斯越桔资源的保护与利用，工厂化繁殖提供一定的科技支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

通过对沈阳市浑南区高坎街道皇冠蓝莓宝石庄园的15个无性系笃斯越桔综合评定，筛选出优良无性系笃斯越桔，对此无性系的150株笃斯越桔品质进行综合评价，筛选出优良单株2015-Z。

1.2 方 法

1.2.1 外植体选择

选取笃斯越桔2015-Z优良单株2～5节处成熟、健康且无病虫害叶片和带芽茎段，进行不定芽诱导。先将外植体清洗洁净，用0.1%HgCl2浸泡4 min，用无菌水冲洗3次。在叶片的远轴面靠近中脉处横切两刀，然后将叶片远轴面向上接种。带芽茎段剪成长0.5～1.0 cm。

将灭菌后的两种外植体均接种到改良的WPM+ZT 1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+琼脂粉6.5 g·L-1上培养，pH值调至6.0。各接种10瓶，3次重复，30 d后调查诱导结果。

1.2.2 灭菌方法筛选

将带芽茎段剪成长1.0～2.0 cm的小段，清水冲洗后，采用9种处理进行灭菌(表1)。将灭菌后的带芽茎段用无菌水冲洗3次，接种至改良WPM培养基上。每个处理10个茎段，3次重复，2周后观察外植体存活以及感染情况。

表1 带芽茎段的灭菌处理

初代培养基、增殖培养基和生根培养基均添加蔗糖25 g·L-1、琼脂粉6.5 g·L-1，pH值调至6.0。

1.2.3 笃斯越桔初代诱导

将1.0～1.5 cm的带芽茎段接种于添加玉米素ZT(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1)的改良WPM培养基上，每个处理接种10瓶，每瓶5个茎段，3次重复，接种后20 d观测记录芽苗诱导情况。

1.2.4 笃斯越桔增殖培养

腋芽伸长至2 cm左右时，将试管苗转接于添加不同激素的改良WPM培养基中。不同激素配比分别为：IBA 0.5 mg·L-1；ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1；ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1；ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1； IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ZT 1.5 mg·L-1；IBA 0.5 mg·L-1+ZT 0.5 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1；IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1+ KT 1.0 mg·L-1；IBA 1.5 mg·L-1+ ZT 1.5 mg·L-1+ KT 1.5 mg·L-1。每个处理接种10瓶，每瓶5个带芽茎段，3次重复，培养30 d后记录增殖结果。

1.2.5 光照强度对试管苗增殖影响

将初代培养的试管苗转移到改良的WPM+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的培养基中，采用太阳光+2 000 lx(处理Ⅰ)、2 000 lx(处理Ⅱ)、3 000 lx(处理Ⅲ)三种光照条件进行组织培养。每个处理10瓶，每瓶转5个单芽茎段，3次重复。30 d后调查苗高、增殖率、增殖系数等。

1.2.6 笃斯越桔生根培养

剪取2.0 cm左右的笃斯越桔试管苗，转接到生根培养基上。以1/2WPM(改良)培养基为基本培养基，添加激素和培养方式见表2。每个处理接种10瓶，每瓶5个单芽茎段，3次重复，50 d后调查生根情况。

表2 笃斯越桔生根培养正交试验水平和因素

1.3 数据处理

采用Excel软件进行数据整理，SPSS软件进行方差分析及多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

接种10 d后，茎段底部开始有淡绿色的愈伤组织产生，接种20 d后，愈伤组织开始形成，部分茎段出现不定芽。叶片诱导的愈伤组织为白色或淡黄色，生长迟缓，其中一小部分愈伤组织能分化出不定芽，有些则褐化致死。接种30 d后，叶片褐化率较高，诱导率较低；茎段褐化率相对较低，诱导率较高(表3)。因此，选用带芽茎段作为笃斯越桔组培的外植体。

表3 不同外植体对愈伤组织诱导的影响

2.2 不同灭菌方法比较

从表4可以看出，75%乙醇和2%次氯酸钠混合处理的灭菌效果均不理想，污染率极高。而用75%乙醇浸泡20 s，再用0.1%HgCl2浸泡3 min，外植体污染率较低，出芽率最高。

表4 不同灭菌方法的灭菌效果

2.3 笃斯越桔初代培养基的筛选

接入初代培养基10 d，个别茎段已经呈现出浅绿色愈伤组织。从表5可以看出，培养20 d后，添加ZT的培养基均能诱导芽苗分化。其中，ZT质量浓度为1.0 mg·L-1时，笃斯越桔试管苗分化系数和分化率最高，生长速度较快，苗高且壮。所以，笃斯越桔最适初代培养基为WPM(改良)+ZT 1.0 mg·L-1。

表5 ZT对笃斯越桔试管苗诱导的影响

2.4 笃斯越桔增殖培养基的筛选

笃斯越桔试管苗经过30 d增殖培养后，所有处理的笃斯越桔苗均有不同程度的增殖。从增殖率及增殖系数可以看出，ZT对笃斯越桔增殖影响最大，起到了决定性作用，其次是IBA。由表6可知，IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1的增殖率和增殖系数均最高，且苗木粗壮，生长较旺盛，木质化程度高。因此，笃斯越桔最佳增殖培养基为WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1。

表6 笃斯越桔试管苗增殖培养结果

2.5 不同光照强度对试管苗增殖的影响

从表7可以看出，不同光照强度的组培苗，在前2周培育时，各生长性状没有显著差异，但从第3周开始，在不同光强的培养下，幼苗生长逐渐呈现不同，培养第5周，处理Ⅰ繁育的苗木分化数最多，且茎秆粗壮，叶片绿色并富有光泽，有效地克服了玻璃化现象。虽然在苗高上逊于处理Ⅲ，但差异不显著。因此处理I，即太阳光+2 000 lx光照条件，更适宜笃斯越桔试管苗的增殖培养。

表7 不同光照强度试管苗生长状况

2.6 笃斯越桔生根培养基的筛选

正交试验表中K值越大，因子水平越高；R值越高(即极差范围)，因子间差距越大。由表8可以看出，激素类型和激素质量浓度对生根率有显著影响，培养方式对生根率影响不显著。在1/2WPM(改良)培养基中添加激素NAA，笃斯越桔试管苗生根效果普遍不好，而在添加IBA的培养基中，笃斯越桔试管苗生根率普遍较高。另外，激素质量浓度也很重要，激素质量浓度为1.0 mg·L-1的试管苗生根率均高于同种激素的其它质量浓度。综上所述，笃斯越桔最适生根培养基为1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，最适生根培养方式为接种后首先放置于暗培养室中暗培养10 d，随后转移到光照强度2 000 lx下培养30 d，生根率72%，且苗木生长旺盛、根系粗壮。

表8 笃斯越桔试管苗生根培养正交试验

3 结论与讨论

在本研究中笃斯越桔优良单株2015-Z的最佳外植体为带芽茎段，不仅可以节省材料，且褐化率低、诱导率高，可在短时间内繁育出大批的优良苗木，同时可加速繁育效率，这与李冰[10]的结果一致。

掌握外植体的灭菌方法是获得无菌苗的基础，灭菌时间过短可致使细菌、霉菌滋生，出现大面积污染；灭菌时间太长可造成酚污染，使试管苗生长发育受限，严重可死亡。用清水将笃斯越桔外植体洗净，然后用75%乙醇浸泡20 s、0.1%升汞浸泡3 min，用无菌水冲刷3次的灭菌效果最佳。这与邢玉春[11]对沉水植物所用的灭菌方法一致。

玉米素(ZT)质量浓度为1.0 mg·L-1的改良WPM培养基诱导分化效果最佳，笃斯越桔试管苗分化系数10.8，分化率38%，试管苗生长速度较快，苗高且壮。这与刘淑英[11]的研究结果一致。从笃斯越桔试管苗增殖率、增殖系数可以得出，玉米素对笃斯越桔增殖影响最大，起到了决定性作用。可见，最佳增殖培养基应为WPM(改良)+ IBA 1.0 mg·L-1+ZT 1.0 mg·L-1，增殖率92%，增殖系数20.40，此时幼苗健壮，生长较旺盛，木质化程度高。李冰[10]在笃斯越桔的研究中也得出质量浓度为1.0 mg·L-1的ZT可以使不定芽茎变粗，叶片增大，增加体系的稳定性。

强光照条件会抑制细胞增长，进而增进细胞分化，试管苗株型紧凑，叶片为绿色；而弱光条件有助于细胞的增长，同时延缓细胞分化，株高增加，出现徒长现象。通过对试管苗不同光照强度培养效果分析，发现利用太阳光与日光灯混合的方式可以有效地促进笃斯越桔试管苗增殖分化，并能控制苗木的徒长。

笃斯越桔属于较难生根的植物，通过对生根试验的结果分析，激素种类是影响笃斯越桔生根率的最大因素，起决定性作用，其次就是激素质量浓度。最适生根培养基为1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1，适宜的生根方式是暗培养10 d，然后转移到光照下(光照强度2 000 lx)培养30 d，试管苗的生根率达72%，且苗木生长旺盛、根系粗壮。这与兰士波[13]对野生笃斯越桔的研究一致，生根培养基都为1/2WPM(改良)+IBA 1.0 mg·L-1。