使用多重PCR检测奶牛乳房炎乳汁中的病原菌

张玉龙 ， 左之才 ， 王 宇 ， 崔耀成 ， 李志强 ， 姚彩霞 ， 黄赞恒 ， 才冬杰

(四川农业大学动物医学院 环境公害与动物疾病四川省高校重点实验室 动物疫病与人类健康四川省重点实验室 ， 四川 雅安 625014)

奶牛乳房炎是世界上公认的尚未完全解决的奶牛疾病难题之一，是奶牛中最普遍且治疗费用昂贵的疾病之一[1-2]。奶牛乳房炎难以根治的原因是该病病情易反复[3]，其病因受多因素影响，如物理性损伤、化学性刺激、机体应激性和外界病原微生物感染等[4]，而病原微生物感染而引发奶牛乳房炎占主导因素，其中重要的病原菌有金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)、无乳链球菌(Streptococcusagalactiae,S.agalactiae)、绿脓杆菌(Pseudomonasaeruginosa,P.aeruginosa)等[5-7]。

近年来，不同地域养殖场乳房炎的主要致病菌有所差异，且临床型乳房炎、隐性乳房炎发病率也有差异性[8-10]。李利山等通过传统细菌学方法对天津部分地区养殖场的奶牛隐性乳房炎进行细菌学调查，结果显示，临床型乳房炎乳样中S.aureus检出率为40.60%，S.agalactiae为3.10%；亚临床乳房炎乳样品中，S.aureus检出率为44.19%[11]。张明国等对四川省攀西地区进行了奶牛乳房炎病原菌区系调查，结果发现，P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae在攀西地区已成为主流病原菌[12]。国内学者对奶牛乳房炎病原菌的诊断进行了大量的研究，可以用多重PCR快速诊断引起奶牛乳房炎的病原体的种类、区系分布以及血清型[13-14]。本试验选择传统细菌学检测方法和本实验室已建立的多重PCR检测方法，分别对3个大型奶牛养殖场进行P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae病原菌检测，通过对比2种方法检测病原菌的检出率和吻合率，更好地探究乳房炎奶样中P.aeruginosa、S.aureus、S.agalactiae的感染情况。

1 材料与方法

1.1 菌株 金黄色葡萄球菌(CMCCB26001)、无乳链球菌(CICC10465)和绿脓杆菌(CMCC10104)等菌种，均购自于北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 送检样本 2018—2019年间，四川洪雅A场(1 000头规模)、四川邛崃A场(600头规模)、四川普州A场(1 000头规模)3个奶牛场出现奶牛乳房炎，牛场工作人员采集奶样(以每头牛的患病乳区为单位)经加州乳房炎检测法(CMT)检测鉴定奶样感染类型。经判定临床型111份、隐性型64份、健康奶样16份，由本实验室采用传统细菌学检测法与多重PCR检测法进行病原菌检测。

1.3 试剂与仪器 DL2 000 DNA Marker、2×TaqPCR Master Mix(Blue)、灭菌双蒸水，均购自成都擎科伟业生物技术有限公司。大豆胰蛋白胨琼脂培养基、脑心浸液肉汤(HBI)、卵黄甘露醇高盐培养基、绵羊鲜血琼脂培养基、伊红美蓝培养基，均购自成都浩博优有限公司。PCR仪(Thermo Fisher，SimpliAmpTM)，电泳仪(北京六一生物科技有限公司，DYY-6D)，全自动凝胶成像系统(Bio-Rad，GelDoc公司)。

1.4 方法

1.4.1 传统细菌学方法

1.4.1.1 样本处理 奶样先3 000 g离心10 min，弃去上清液，用接种环挑取沉淀物，在绵羊鲜血琼脂培养基进行划线，置37 ℃恒温箱培育24 h，观察菌落生长形态。再取不同形态的菌落接种在麦康凯琼脂、KF链球菌琼脂、甘露醇高盐琼脂选择培养基，观察细菌的生长情况，进一步进行细菌革兰染色，显微镜检查等。

1.4.1.2 生化试验 用接种环将细菌接种指定的生化培养基，放置37 ℃恒温培养箱内，经24 h培养后判定结果，将各项生化反应的结果与伯杰细菌手册[15]进行对比。主要生化特性指标有麦芽糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、葡萄糖、木糖、甘露醇、F-发酵、明胶液化、触酶、V-P、葡萄球菌凝固酶、覃糖、环腺苷酸(CAMP)。

1.4.1.3 16S rRNA的测序 挑选每批样品中部分菌落形态、染色镜检和生化结果一致的疑似菌株进行16S rRNA基因测序分析，将测序序列在NCBI上比对结果，并记录好细菌种属情况。

1.4.2 多重PCR检测方法

1.4.2.1 奶样的处理 奶样先进行混匀处理，取2 mL样品3 000 g离心10 min，倒掉上清液并无菌挑取管底沉淀物接种到脑心浸液肉汤，置37 ℃恒温箱培养24 h。

1.4.2.2 PCR模板的制备 先将过夜培养的脑心浸液肉汤培养基12 000 g离心2 min，弃去上清液，用双蒸水将菌体沉淀混匀制成模板。

1.4.2.3 多重PCR反应条件 反应体系和条件参考文献[16]，将制备好的模板进行多重PCR反应。

1.4.3 吻合率计算 检测吻合率/%=(2种检测方法检测的相同阳性个数+相同阴性个数)/被检测的样本量总数×100%。用SPSS 22软件进行数据处理，用x2检验对检出率数据进行分析，以P<0.05为显著差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 传统细菌学方法的分离鉴定

2.1.1 细菌的培养及镜检 甘露醇高盐培养基上疑似S.aureus菌株生长呈金黄色菌落且菌落周围会形成1个黄色的晕环，革兰染色镜检为可见菌落染色呈阳性，形态是呈椭圆形，单个、成对或葡萄串状排列。绵羊鲜血培养基上疑似S.agalactiae菌株生长呈β溶血的湿润、乳白色菌落，染色镜检呈阳性，形态是呈成对、成链排列。普通琼脂培养基上疑似P.aeruginosa菌株呈光滑、微隆起、边缘整齐波状，并且普通琼脂培养基表面呈黄绿色，染色镜检为阴性菌，形状是呈成对或偶尔成短链排列。

2.1.2 细菌的生化试验 经24 h培养后，根据伯杰细菌手册标准株的生化特性进行细菌分类。在细菌形态、染色镜检归类的基础上，通过细菌的生化结果判定样品中S.aureus35株、S.agalactiae48株、P.aeruginosa16株。

2.1.3 16S rRNA测序 挑选每批样品中部分细菌形态、染色镜检和生化结果一致的疑似菌株进行PCR扩增，将扩增的PCR产物进行核酸凝胶电泳试验，通过全功能成像仪观察凝胶电泳结果，见图1。

图1 PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification resultsM：DL2 000 DNA marker； 1:阴性对照； 2～8：阳性样品M:DL2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2-8:Positive samples

将跑出目的条带的阳性样本进行测序，并在NCBI上对得到的核苷酸序列进行比对。结果显示，疑似S.aureus菌株与GenBank中已有S.aureus序列的相似性均高于99.79%，疑似S.agalactiae菌株与GenBank中已有S.agalactiae序列的相似性均高于99.77%，疑似P.aeruginosa菌株与GenBank中已有P.aeruginosa序列的相似性均高于99.86%。

2.1.4 传统细菌学检测方法的检出率 在传统细菌学方法鉴定中，单独检出9份S.aureus阳性奶样，单独检出26份S.agalactiae阳性奶样，单独检出2份P.aeruginosa阳性奶样。检出13份S.aureus+S.agalactiae阳性且P.aeruginosa阴性的奶样，检出5份S.aureus+P.aeruginosa阳性且S.agalactiae阴性的奶样，检出1份S.agalactiae+P.aeruginosa阳性且S.aureus阴性的奶样，同时检出3种菌阳性的有8份奶样。

2.2 多重PCR检测方法

2.2.1 多重PCR检测方法的检出率 多重PCR检测法中，用多重PCR的条件与体系进行PCR扩增(图2、图3)。结果显示，单独检出10份S.aureus阳性奶样，单独检出30份S.agalactiae阳性奶样，单独检出6份P.aeruginosa阳性奶样。检出16份S.aureus+S.agalactiae阳性且P.aeruginosa阴性的奶样，检出10份S.aureus+P.aeruginosa阳性且S.agalactiae阴性的奶样，检出5份S.agalactiae+P.aeruginosa阳性且S.aureus阴性的奶样，同时检出3种细菌阳性的有9份奶样。

图2 部分样品PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker； 1～12、14、15:隐性乳房炎样品； 13:正常奶样； 16：阴性对照M:DL2 000 marker; 1-12,14,15:Subclinical mastitis sample; 13:Normal milk sample; 16:Negative control

图3 部分样品PCR扩增结果Fig.3 PCR amplification results of some samplesM:DL2 000 marker; 1～6：临床型乳房炎样品； 7：阴性对照M:DL2 000 marker; 1-6:Clinical mastitis milk sample; 7:Negative control

2.3 2种方法的细菌检出率与吻合率 通过传统细菌学检测法与多重PCR检测法2种方法对111份临床乳房炎奶样、64份隐性乳房炎奶样、16份正常奶样中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa进行检测，并用卡方检验对不同感染类型进行分析，检出份数结果见表1。通过吻合率公式进行2种检测方法吻合率比较，在111份临床型乳房炎奶样中，2种方法关于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的检出吻合率分别为92.8%、96.4%和90.1%。在64份隐性乳房炎奶样中，2种方法关于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的检出吻合率分别为96.9%、89.1%和96.9%。在16份正常奶样中，2种方法关于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的检出吻合率分别为100%、93.8%和93.8%。2种方法关于S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的总体检出吻合率分别为94.8%、93.7%和92.7%。在S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的单一感染和复合感染的检测中，无论是临床型乳房炎奶样还是隐性乳房炎奶样其检出吻合率均在92%以上。

表1 乳样中细菌检出的结果Table 1 Results of total bacterial detection in milk samples

运用2种方法检测111份临床乳房炎样品中的病原菌，多重PCR检测法检出74株致病菌，检出率为66.7%，传统细菌学培养法检出51株致病菌，检出率为45.9%，通过卡方检验得出多重PCR检测方法与传统细菌学检测方法差异显著(P<0.05)，具有统计学意义。结果表明多重PCR检测法可以在临床乳房炎奶样中进行致病菌的检测，临床应用效果比较好，并且多重PCR检测法在绿脓杆菌检测中敏感性比较高(表2)。

表2 2种方法对临床乳房炎中致病菌的检出率比较Table 2 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in clinical mastitis by two methods

运用2种方法检测了64份隐性乳房炎样品中的病原菌，多重PCR检测法检测出56株致病菌，检出率为87.5%，传统细菌学培养法检测出45株致病菌，检出率为70.3%。通过卡方检验得出多重PCR检测方法与传统细菌学检测方法差异显著(P<0.05)，具有统计学意义。结果表明多重PCR检测法可以运用于隐性乳房炎奶样致病菌的检测，临床应用效果比较好(表3)。同时，在16份正常奶样中，通过卡方检验得出多重PCR检测方法与传统细菌学检测方法差异不显著，可能与正常乳样的污染程度小，细菌检出率低等相关。

表3 2种方法对隐性乳房炎中致病菌的检出率比较Table 3 Comparison of detection rates of pathogenic bacteria in subclinical mastitis by two methods

2.4 总样品检出率的比较 用2种方法对191份牛奶样本进行检查，对不同的感染类型进行卡方检验分析，具体结果见表4。191份临床样品中,多重PCR检测方法检测出135株致病菌,检出率为70.7%,传统细菌学培养法检测出99株致病菌,检出率为51.8%,通过卡方检验得出多重PCR检测方法与传统细菌学检测方法差异极显著(P<0.05)，具有统计学意义。结果表明多重PCR检测法可以应用于奶样中混合致病菌的检测，临床应用效果比较好。

表4 2种方法对不同类型致病菌的检出率比较Table 4 Comparison of detection rates of different types of pathogenic bacteria by two methods

3 讨论

3.1S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa的检出率情况 据报道S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等病原菌感染是引起奶牛乳房炎的主要病原菌[17-19]。2005年，刘文进等[20]对新疆垦区的7个奶牛场进行调查发现，S.aureus已经取代链球菌成为最主要致病菌，并且P.aeruginosa的检出率明显增加。在本试验中，通过对患有乳房炎临床样品检测，结果与罗金印等[21]报道结果基本一致，但与国内其他地区报道结果不一致[22-25]，这说明细菌感染率与地理位置和养殖环境相关。同时，丁天翊等[26]报道，奶牛乳房炎中S.agalactiae的检出率比较高，并且混合菌株感染比单一菌株感染率高。聂培[27]研究发现，奶牛乳房炎病原菌分离中S.aureus检出率为14.7%，混合感染率达77.4%。本试验采用2种不同的检测方法，发现3个奶牛场的S.agalactiae感染比较严重，重点加强无乳链球菌的预防和治疗，混合感染率高于单菌株感染率。结果显示，3个奶牛场的隐性乳房炎感染情况比较严重，加强隐性乳房炎的预防和治疗。

3.2 传统细菌学培养法与多重PCR检测方法的比较 目前已有研究者建立了S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa等细菌的多重PCR检测方法，多重PCR检测相较于传统细菌学培养法具有灵敏度高、可信度强等优势[28-29]。前期建立的用于奶牛乳房炎的多重PCR检测方法，没有涉及P.aeruginosa细菌。目前，P.aeruginosa引起奶牛乳房炎的发生及检出率增加，应开展针对P.aeruginosa及乳房炎相关病原菌如S.aureus、S.agalactiae等的检测方法研究，本试验建立的多重PCR检测方法可同时检出S.aureus、S.agalactiae、P.aeruginosa。本试验通过检测111份临床型乳房炎奶样并统计检出S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa阳性数据可知，传统细菌学检测方法分别为19份、20份、12份；多重PCR方法分别为27份、24份、23份，可推测多重PCR检测法在临床型乳房炎奶样检出能力强于传统细菌学培养法。结合2种方法在64份隐性乳房炎样品及16份正常奶样中S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa阳性奶样的检出率与吻合率，结果显示多重PCR检测法的检测效果与传统细菌学检测方法效果吻合度均在92%以上。同时，通过卡方检验对临床乳房炎样品、隐性乳房炎样品及正常奶样品的2种方法检测结果进行检验，得出临床乳房炎样品及隐性乳房炎样品中多重PCR检测方法与传统细菌学检测方法差异显著(P<0.05)。本试验建立的多重PCR检测方法可用于生产实践中，在临床乳房炎样品中检测S.aureus、S.agalactiae和P.aeruginosa三种细菌的结果准确可信，有利于降低检测成本和节省确定病原菌时间[30-31]。