核酸适配体氯化血红素比色法检测牛奶中的氯霉素

孙怀霞，王令臣，林郑忠，洪诚毅，黄志勇

(集美大学食品与生物工程学院，福建 厦门 361021)

0 引言

氯霉素(chloramphenicol,CAP)属抑菌性广谱抗生素，曾被用于渔业和畜牧业[1-2]。但是，长期摄入含CAP的食物会对人体产生骨髓抑制、再生性贫血及“灰色婴儿综合症”等危害[3-4]。因此，欧盟规定，动物源食品中CAP不得检出。2007年，我国农业部也宣布在兽医学中禁止使用CAP[5]。因此，对CAP残留的检测至关重要。目前，CAP检测方法有色谱法[6-9]、表面增强拉曼散射法[10]、分子印迹法[11]、化学发光芯片免疫法[12]、量子点修饰的电化学方法[13]、直接竞争酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[14]等。但这些方法由于操作繁琐且耗时，仪器设备昂贵且还需要专业人员操作[15]。因此，建立一种快速、简便的CAP检测方法具有实际意义。

核酸适配体是通过体外配体指数级富集系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)从人工构建的寡核苷酸文库中筛选出来的单链寡核苷酸序列[16]，具有结合范围广、成本低、毒性小和易于合成修饰[17]等优点，已应用于多种传感检测中，如电化学[18]、金纳米粒子[19]、石墨烯材料[20-21]、荧光[22]和电化学发光[23]等。但是这些方法存在一些不足，例如荧光检测实际样品时背景荧光干扰严重，容易导致检测结果假阳性[22]；电化学及电化学发光法需要对电极进行设计，可能会降低识别能力，检测性能的稳定性难以保证[24]；石墨烯和金纳米粒子结合适配体检测方法制备可用的金纳米粒子处理较为繁琐，限制了其大规模应用[21]。因此，需要开发一种灵敏、简便的适配体方法检测CAP。

氯化血红素(hemin)是许多天然酶重要的催化辅助因子，已被用于构建多种生物检测方法[25]，其中包括具有过氧化物酶性质的G-四链体/hemin酶[26]和hemin-还原石墨烯-金复合材料的设计[27]。此外，由于hemin在水溶液中溶解性较差，易聚集成低催化活性的hemin二聚体，将其修饰在DNA上可显著提高其溶解度，维持其单体结构以保持较高的催化活性[28]。

本文设计了一种基于适配体和hemin的比色方法，可用于快速检测牛奶中的CAP含量。此方法以hemin为过氧化物模拟酶，通过调节其对四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)的氧化催化活性实现对CAP的定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

Hemin-核酸适配体[29]序列为5′-ACTTCAGTGAGTTGTCCCACGGTCGGCGAGTCGGTGGTAG-hemin-3′，hemin-cDNA序列为5′-hemin-CTACCACCGACTCGC-3′，购自上海生工生物技术有限公司；CAP、四环素(tetracycline,TC)、土霉素(oxytetracycline,OTC)、金霉素(chlorotetracycline,CTC)、磺胺(sulfonic acid,SA)和TMB均购自百灵威科技有限公司；过氧化氢和氯化钠购自国药集团化学试剂有限公司；十二水合磷酸二氢钠(NaH2PO4·12H2O)、二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)和三水合乙酸钠(NaAc·3H2O)购自西陇化工股份有限公司。DNA储备液介质是磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.0，100 mmol/L NaH2PO4，100 mmol/L Na2HPO4)。反应缓冲液为HAc-NaAc(pH= 4.0，50 mmol/L HAc-NaAc，100 mmol/L NaCl)。反应终止液为2 mol H2SO4。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

SpectraMax plus 384型酶标仪，美国Molecular Devices公司；PDA UV/VIS Lambda 265型紫外分光光度计，美国PerkinElmer公司；arium bagtank 50水纯化系统，德国赛多利斯公司。

1.3 样品预处理

牛奶样品购自当地超市，并在分析前进行预处理。称取牛奶试样约2 g于10 mL离心管中，加4 mL乙腈，振荡充分，13 000 r/min离心10 min，提取液置于离心管中，氮气吹干。再用2 mL PBS溶解，加2 mL环己烷，充分振荡后于13 000 r/min 离心10 min，弃上层(即正己烷层)以除去脂肪，取下层水相过膜后进样分析[30-31]。

1.4 CAP检测

将两条DNA链在90 ℃退火10 min，在100 mmol/L PBS缓冲液中将等体积4 μmol/L的hemin-aptamer和hemin-cDNA溶液于室温下混合反应20 min，获得2 μmol/L的双链DNA。取20 μL双链DNA与不同浓度CAP于25 ℃孵育1 h，向其中加入TMB、H2O2和缓冲液至总体积为200 μL。由于TMB氧化显色时间较长，难以达到稳定，因此，将反应溶液于25 ℃孵育15 min后立即加入50 μL H2SO4溶液(2 mol/L)以终止反应，加入H2SO4后溶液颜色由蓝色转变为黄色，最大吸收波长由652 nm 转变为452 nm，记录452 nm处溶液的吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 实验原理

此方法引入两条hemin单体修饰的DNA链，在检测体系中无CAP时，两条DNA单链由于互补杂交形成DNA双链，由于修饰在单链上的hemin单体相互靠近形成二聚体，使其过氧化物酶活性降低。而当体系中有CAP时，由于CAP与核酸适配体特异性结合，导致DNA双链解离，hemin二聚体解聚成单体，过氧化物酶活性恢复，可有效催化H2O2氧化TMB，生成蓝色氧化物，由溶液颜色深浅的变化可判断CAP的含量，通过记录452 nm处的吸光度值，实现CAP定量分析。

2.2 实验可行性

如图1所示，hemin单体(曲线a)在402 nm处显示出吸收峰，修饰hemin的单链DNA(曲线b)在260 nm处显示出DNA吸收峰和hemin单体吸收峰；而由适配体和互补链形成的DNA双链(曲线c)在378 nm处出现一个新的吸收峰，此吸收峰为hemin二聚体的吸收峰，表明成功合成了DNA双链。如图2所示，当体系中无CAP存在时(曲线a)的吸光度值比有CAP存在时的(曲线b、c)低。同时，高浓度CAP(30 nmol/L) 所产生的吸光度值比低浓度CAP(5 nmol/L) 所产生的吸光度值大，表明所建立的方法可有效检测CAP。

2.3 条件优化

实验对hemin修饰的DNA浓度、缓冲体系的种类、缓冲液中Na+浓度、pH、TMB和H2O2的浓度分别进行了优化。考察1～5 μmol/L hemin修饰的DNA浓度对实验的影响，发现DNA浓度越大，信号的吸光度值越大，但浓度为2 μmol/L时信号的吸光度值就可满足检测要求。为了节约成本，选择hemin修饰的DNA浓度皆为2 μmol/L。实验还考察了PBS、NaAc-HAc和4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲体系对实验的影响发现，在NaAc-HAc缓冲液中，TMB被氧化显色较理想，因此选择缓冲液为NaAc-HAc。还对NaAc-HAc缓冲液中Na+浓度(50～200 mmol/L)进行了优化，当Na+浓度小于100 mmol/L时，DNA双链结构不稳定；而Na+浓度太高时，双链结合牢固，使得CAP很难与适配体结合。因此选择Na+浓度为100 mmol/L。

NaAc-HAc缓冲液的pH值优化结果如图3a所示，缓冲液pH值越大，反应溶液的吸光度值越小，而在pH=4.0时，吸光度值最大。可能原因是在此条件下，TMB被催化氧化更彻底。因此，缓冲液的pH值选择4.0。TMB浓度对CAP检测的影响如图3b所示，TMB浓度越大，溶液吸光度值越大，而当TMB浓度高于0.9 mmol/L时，溶液的吸光度值开始减小，这可能是TMB 在水溶液中溶解度较低，在一定范围内，反应溶液的吸光度值随TMB浓度增大而增大，而TMB过量时不能充分溶解，导致其吸光度值减小。因此，实验选择TMB的浓度为0.9 mmol/L。图3c为H2O2浓度对CAP检测的影响，随着H2O2浓度从60 mmol/L增加到140 mmol/L，溶液的吸光度值先增大后减小，当H2O2浓度为100 mmol/L时，溶液的吸光度值最大。因此，选择H2O2浓度为100 mmol/L。

2.4 线性关系

实验考察了1～30 nmol/L范围内CAP浓度与溶液吸光度值的响应关系，如图4a所示，随着CAP浓度增加，溶液在452 nm处的吸光度值也逐渐增加。图4b表明，CAP在1～30 nmol/L范围内，吸光度值与CAP浓度呈现良好的线性关系，线性方程为y=0.019 9x+1.223，相关系数R2=0.976，检出限为0.315 nmol/L(3σ，n=9)。

如表1 所示，与色谱法、表面增强拉曼散射法、直接竞争ELISA法、分子印迹法、化学发光免疫以及其他基于适配体的检测方法相比，本方法具有较低的检测限，线性范围较宽，实验过程也较为简便快速，可用于痕量CAP的检测。

表1 本方法与其他CAP检测方法的比较

2.5 选择性和干扰

为了分析所建立的方法对CAP的选择性，实验选取TC、OTC、CTC和SA等常见抗生素，考察其对探针的响应程度。将CAP浓度设为30 nmol/L，而其他抗生素的浓度均为60 nmol/L。图5的结果表明，除了CAP，其他抗生素的信号响应都较低。而当加入CAP时，吸光度值增大，说明此方法对CAP检测有良好的选择性。将其他抗生素与CAP混合且浓度均设为30 nmol/L，混合液的吸光度值与单独检测CAP的吸光度值相近，表明其他物质对CAP的检测没有产生明显的干扰。

2.6 实际样品检测

为了考察此方法在实际样品中检测CAP的性能，实验选取了市售牛奶样品进行试验，结果未检出。对该样品进行加标回收试验，选取4个加标水平，每个水平平行3份，结果如表2所示，牛奶样品中CAP的加标回收率为95.5%～116.0%，表明该方法可用于牛奶样品中CAP的检测。

表2 牛奶样品中CAP的回收率

3 结论

通过加入CAP可调节修饰在DNA链中的氯化血红素的过氧化物酶活性，进而通过酶催化TMB与H2O2的氧化反应快速检测CAP。在优化条件下，CAP检测的线性范围为1～30 nmol/L，检测限为0.315 nmol/L，在牛奶样品中的加标回收率为95.5%～116.0%，表明所建立的方法快速、准确。