表没食子儿茶素没食子酸酯对牙龈卟啉单胞菌细菌毒力抑制作用的体外研究

齐霞， 孔令雪， 李淑娟， 马思婷， 齐雅丽， 赵蕾

1. 河北医科大学口腔医学院·口腔医院牙周一科，河北省口腔医学重点实验室，河北省口腔疾病临床医学研究中心，河北 石家庄（050017）； 2.济南口腔医院牙周黏膜科，山东 济南（250001）； 3.口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院牙周科，四川 成都（610041）

牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.gingivalis）是牙周炎的主要致病菌。P. gingivalis 参与形成龈下菌斑生物膜，通过改变生物膜的组成及负荷，引起菌群失调，与牙周疾病的发生发展及治疗失败相关［1⁃3］。P. gingivalis 可分泌牙龈素等毒力因子直接破坏牙周组织［4］，同时，还可入侵宿主细胞使其释放大量炎症因子，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs），导致牙周组织的继发性损伤［5⁃7］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocate⁃chin⁃3⁃gallate，EGCG）是绿茶儿茶酸中最主要成分，占其总重的59%。研究显示每天饮用1 杯绿茶，可显著降低牙周病的发病率及严重程度［8］。用P.gin⁃givalis 感染小鼠构建牙周炎动物模型，口腔内注射40 mg/kg 的EGCG 溶液4 周发现，实验组牙周组织炎症显著减轻，且血液中上调的白介素⁃1β（interleukin⁃1β，IL⁃1β）表达水平显著降低［9］，提示EGCG 可减轻P.gingivalis 引起的牙周炎症，但其具体机制仍有待深入探究。本研究探讨EGCG 对P. gingivalis 生物膜、毒力因子的抑制作用及EGCG 对P. gingivalis 刺激的人牙龈成纤维细胞（human gingival fibroblasts，HGFs）分泌MMPs的能力。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和仪器

EGCG（杭州禾田生物制品有限公司）；P. gin⁃givalis ATCC33277 由四川大学口腔疾病研究国家重点实验室提供；心脑浸出液培养基（brian heart infusion，BHI）（Oxiod，英 国）；XTT 试 剂 盒（Syn⁃chem，美国）；精氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（argi⁃nine gingipain，Rgp）特异性产色底物、赖氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（lysine gingipain，Kgp）特异性产色底物、二硫苏糖醇（Dithiothreitol，DTT）（Sigma，美国）；胎牛血清、DMEM 培养基（Hyclone，美国）；Trizol（Invitrogen，美国）；人MMP⁃1、MMP⁃1 ELISA试剂盒（优尔生科技股份有限公司，中国）；RNA 逆转录试剂盒、qRT⁃PCR 试剂盒（TakaRa，日本）。酶标仪（Thermo，美国）；扫描电镜（Inspect FEI，荷兰）；ABI7300 荧光定量PCR 仪（Applied Biosystems，美国）。

1.2 EGCG 对P.gingivalis 浮游菌生长的影响

采用微量稀释法梯度稀释EGCG 并加入96 孔板 中 与1 × 108CFU/mL P. gingivalis 菌 悬 液 各100 μL 混合，使EGCG 终浓度为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL，于37 ℃厌氧培养24 h 后，酶标仪A655nm测吸光度值，确定最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）及最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration，MBC）。另设不含EGCG的空白对照组。每组设3个平行孔。

1.3 EGCG 对P.gingivalis 生 物 膜 的 影 响

1.3.1 结晶紫染色法检测EGCG 对P. gingivalis 生物膜形成的抑制作用 将P. gingivalis 菌悬液（100 μL 每孔）与不同浓度EGCG（100 μL 每孔）37 ℃厌氧共培养24 h，另设阳性对照组（100 μL BHI 及100 μL P. gingivalis 菌悬液），阴性对照组（200 μL BHI）以及药物对照组（100 μL BHI 及100 μL 不同浓度EGCG）。结晶紫染色，酶标仪A550nm测量吸光度值。药物最低生物膜抑制浓度（minimum biofilm inhibition concentration，MBIC）为与对照组相比，抑制50%或90%生物膜形成的最低 药 物 浓 度，即MBIC50和MBIC90［10］。每 组 设4 个平行孔，实验重复3 次。计算生物膜形成的相对形成率：生物膜形成相对抑制率=1-（实验组A550nm-药物组A550nm）/（阳性对照组A550nm-阴性对照组A550nm）×100%。

1.3.2 结晶紫染色法检测EGCG 对P.gingivalis成熟生物膜的清除作用 P. gingivalis 菌悬液200 μL 培养24 h，形成成熟生物膜，PBS 洗去浮游菌后，加入200 μL微量液体稀释法梯度稀释后终浓度为1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.8、3.9 μg/mL EGCG，分别设置阳性对照组（200 μL P.gingivalis菌悬液），阴性对照组（200 μL BHI）及药物对照组（200 μL 不同浓度EGCG），继续厌氧培养24 h 后，结晶紫染色，测量A550nm下的吸光度值。计算药物最低清除已形成生物膜清除浓度（minimum biofilm reduction concentration，MBRC）［11］，即MBRC50和MBRC90。成熟生物膜相对清除率=1-（实验组A550nm-药物组A550nm）/（阳性对照组A550nm-阴性对照组A550nm）× 100%。

1.3.3 XTT 法检测EGCG 对P. gingivalis 成熟生物膜活性的影响 在P. gingivalis 成熟生物膜中加入不同浓度EGCG，37 ℃厌氧培养24 h 后，每孔加入120 μL XTT⁃甲萘醌混合溶液，37 ℃黑暗培养2 h，测A490nm下的吸光度值。计算成熟生物膜活性的最小抑菌浓度（sessile minimal inhibitory concentration，SMIC）［12］，即SMIC50和SMIC90，固着状态细菌活性相对抑制率=1-（实验组A490nm-药物组A490nm）/（阳性对照组A490nm-阴性对照组A490nm）× 100%。

1.4 扫描电镜观察EGCG 对P.gingivalis 成熟生物膜的清除作用

在24 孔板内放置无菌圆形玻片，EGCG 与P.gingivalis 成熟生物膜共培养24 h 后，2.5%戊二醛固定，乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯液置换，二氧化碳临界干燥，离子溅射表面固定镀膜致材料表面成金黄色，扫描电子显微镜（scanning electron micros⁃copy，SEM）观察分析。

1.5 EGCG 抑制牙龈素的蛋白水解活性

收集P. gingivalis 并稀释至Rgp 组P. gingivalis浓度为A660nm=2，Kgp 组为A660nm=1，4 ℃10 000 g 离心10 min 后，取上清液100 μL，依次加入50 μL 终浓度为0、10、50 μg/mL EGCG，25 μL 0.04 mol/L DTT 及浓度为0.016 mol/L Rgp 或Kgp 特异性产色底物，设无P. gingivalis 的为阴性对照组，将混合物37 ℃暗培养，分别于15 min、30 min、45 min、1 h、2 h、3 h、4 h 在酶标仪A490nm测量吸光度值。

1.6 HGFs 的原代培养

采用酶消化联合组织块法培养人原代牙龈成纤维细胞［7］，第4～6 代用于实验。本研究已获四川大学华西口腔医院伦理委员会批准（批准号：WCHSIRB⁃ST⁃2012⁃067）。

1.7 MTT 法测定P.gingivalis 及EGCG 对牙龈成纤维细胞的细胞毒性

收集对数生长期HGFs 接种于96 孔板，并加入浓度为1、10、50、100、250、500 μg/mL EGCG 或感染复数为50、100、200、250、500 的P. gingivalis，培养24 h 后，依次加入20 μL MTT 及200 μL DMSO，测量并计算细胞存活率。另设不含EGCG 的空白对照组及不含细胞的阴性对照组。

1.8 细胞培养及处理

接种5×105个/mL 的HGFs 于6 孔板，培养24 h；同时，加入P. gingivalis（MOI 值为200）及终浓度为50 μg/mL 和10 μg/mL 的EGCG。另设不含P. gingi⁃valis 或EGCG 的对照组。37 ℃、体积分数为5%CO2恒温细胞培养箱内共培养24 h。11 000 g 离心10 min 收集细胞上清液⁃20 ℃冻存。

1.9 ELISA 法检测MMP⁃1 及MMP⁃2 的蛋白分泌量

采用BCA 蛋白浓度试剂盒测定总蛋白浓度，ELISA 试剂盒检测HGFs 细胞培养上清液中MMP⁃1及MMP⁃2 的含量。

1.10 qRT⁃PCR 分 析P. gingivalis 感 染 的HGFs 中MMP⁃1，MMP⁃2 mRNA 的表达

Trizol 法提取HGFs 总RNA，分光光度计测定总RNA 浓度及纯度。Takara 试剂盒逆转录RNA为cDNA，进行qRT⁃PCR 定量分析。引物序列见表1。扩增条件：预变性（95 ℃30 s）1 个循环；PCR 反应（95 ℃变性5 s，60 ℃31 s）40 个循环，终止反 应（95 ℃5 s；60 ℃30 s；95 ℃15 s）1 个循环。按照2⁃△△Ct法计算各组的目的基因相对表达量。

表1 qRT⁃PCR 反应中引物序列Table 1 The primers sequence of the genes used in qRT⁃PCR

1.11 统计学分析

采用SPSS 21.0 对数据进行统计学分析，定量资料以均数± 标准差（x ± s）表示，符合正态分布与方差齐性的采用单因素方差分析（ANOVA），若不符合采用Kruskal⁃Wallis 非参数检验，组间两两比较采用LSD 法检验或Dunnett's T3 检验。P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EGCG 对P.gingivalis 浮游菌及生物膜的影响

将P. gingivalis ATCC33277 接种于BHI 血琼脂平板，37 ℃厌氧培养24 h，光镜下为革兰氏阴性染色的球杆菌（图1）。EGCG 对P. gingivalis 浮游菌MIC 和MBC 分别为62.5 μg/mL，500 μg/mL（表2）。7.8～125 μg/mL EGCG 对P.gingivalis 生物膜形成具有抑制作用，呈现剂量效应关系（P ＜0.05，图2a）；其中，MBIC50为7.8 μg/mL，MBIC90为31.25 μg/mL。EGCG 对24 h 形成的P. gingivalis 生物膜表现出清除作用，MBRC50为250 μg/mL（图2b）。125 μg/mL的EGCG 即可抑制50%固着状态细菌活性，即SMIC50；62.5～1 000 μg/mL 的实验组生物膜细菌活性均低于空白对照组，差异有统计学意义（图2c，P ＜0.05）。扫描电镜观察结果显示：与对照组相比，实验组生物膜的量明显减少，致密结构变得疏松多孔，1 000 μg/mL EGCG组细胞间几乎无连接（图3）。

图1 P. gingivalis ATCC33277 菌株培养（×1 000）Figure 1 Culture of P. gingivalis ATCC33277（×1 000）

表2 EGCG 对P. gingivalis 浮游菌及生物膜的作用Table 2 Effects of EGCG against P. gingivalis planktonic culture and biofilms

2.2 EGCG 对牙龈素蛋白水解活性的抑制作用

低于MIC 浓度的EGCG 均可抑制Rgp 对蛋白的降解作用（P ＜0.05），10、50 μg/mL 的EGCG 抑制率 分 别 为（49.92 ± 6.41）%，（69.56 ± 3.62）%（图4a），且10、50 μg/mL EGCG 对Rgp 蛋白降解抑制作用在1、2、3、4 h 组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）（图4b）。P. gingivalis Kgp 蛋白水解活性同样被抑制（P ＜0.05），抑制率分别为（37.50 ± 1.91）%和（49.40 ± 3.61）%，50 μg/mL EGCG 对Kgp 蛋白降解抑制作用在3、4 h 组间比较无统计学意义（P＞0.05）（图4c、4d）。

2.3 P. gingivalis 及EGCG 对HGFs 细胞活性影响

与对照组相比，P. gingivalis 在MOI 值250∶1 及500∶1 时对HGFs 的生长有抑制作用（P ＜0.05，图5a）。500 μg/mL EGCG 抑制HGFs 的生长，250 μg/mL 及以下浓度EGCG 对HGFs 细胞存活无影响（图5b）。

2.4 EGCG 对P. gingivalis 刺激下HGFs 表达MMP⁃1、MMP⁃2 水平的影响

与阴性对照组相比，阳性对照组MMP⁃1 和MMP⁃2 的分泌分别上升了1.4 倍和1.6 倍。与阳性对照组相比较，50 μg/mL EGCG 实验组HGFs 上清液中MMP⁃1 和MMP⁃2 的分泌被抑制（P ＜0.05），而10 μg/mL EGCG 对其无明显抑制作用（图6a、6b）。

Figure 2 Inhibitory effect of different concentrations of EGCG on P. gingivalis biofilm图2 不同浓度EGCG 对P. gingivalis 生物膜的抑制作用

Figure 3 Effect of the EGCG concentration on the mature biofilms of P. gingivalis using SEM（× 10 000）图3 SEM 观察不同浓度EGCG 对P. gingivalis 成熟生物膜的影响（× 10 000）

Figure 4 Effect of EGCG on P. gingivalis Rgp and Kgp activities图4 EGCG 对P. gingivalis Rgp 及Kgp 蛋白水解活性的影响

qRT⁃PCR 结果显示：与阳性对照组相比，50 μg/mL EGCG 可显著抑制P. gingivalis 刺激HGFs 后MMP⁃1 和MMP⁃2 mRNA 水平升高（P ＜0.05），10 μg/mL 和50 μg/mL 的EGCG 对MMP⁃1 mRNA 表达的抑制率分别为（28.3 ± 6.58）%和（50.69 ± 6.95）%（P ＜0.05），50 μg/mL 的EGCG 对MMP⁃2 mRNA 表达的抑制率为（62.92 ± 11）%（图6c、6d）。

Figure 6 Effect of EGCG on the secretion of MMP⁃1 and MMP⁃2 by HGFs stimulated by P. gingivalis图6 不同浓度EGCG 对P. gingivalis 刺激后HGFs 表达MMP⁃1 及MMP⁃2 的影响

3 讨 论

绿茶儿茶素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌等多种药理作用，其主要成分EGCG 抗菌作用最强且抗菌谱广［13］。EGCG 可在细胞质膜的脂质层中产生过氧化氢，导致细胞的裂解［14］；螯合细菌生长必须的铁离子，造成菌体营养缺乏［15］。此外，EGCG 还可抑制细胞质二氢叶酸还原酶，从而抑制核酸前体的合成［16］。EGCG 对牙周炎主要致病菌P.gingivalis有抗菌作用，MIC为31.25～500 μg/mL［17⁃20］。本研究结 果 显 示：EGCG 抑 制P. gingivalis ATCC 33277 浮游菌的生长，MIC 为62.5 μg/mL。

菌斑生物膜形成和成熟是牙周病发生的关键，且成熟生物膜中细菌活性更高，较浮游菌对抗生素或宿主防御功能的抵抗作用更强。因此，抑制生物膜形成、清除成熟生物膜和抑制成熟生物膜活性三个方面能较全面反应药物对菌斑生物膜的影响。本研究发现：低于MIC 浓度的EGCG 对P.gingivalis 生物膜的形成有显著的抑制作用，且呈剂量依赖效应关系。以上结果与Ben 等［15］结果类似，在不对细菌生长产生显著影响的前提下，EGCG 可抑制具核梭杆菌生物膜的形成。本研究发现EGCG 对已形成的P. gingivalis 生物膜具有清除作用，扫描电镜分析发现EGCG 改变P. gingivalis成熟生物膜的结构，生物膜致密结构变薄且疏松，细菌量减少。此外，XTT 法检测EGCG 对成熟生物膜 活 性 的 抑 制 作 用，SMIC50为125 μg/mL。Asahi等［21］通过激光共聚焦显微镜发现EGCG 处理组P.gingivalis 成熟生物膜中死菌的比例明显高于对照组，进一步证实EGCG 可抑制成熟生物膜活性。根据以上结果推测：EGCG 可能通过抑制P. gingivalis的黏附，初步抑制生物膜的形成。此外，EGCG 可抑制成熟生物膜的活性并对成熟生物膜有清除作用，形成疏松多孔的生物膜，利于免疫细胞、药物等进一步渗透，并利于机械方法清除龈下菌斑。

多项体外研究证实，EGCG 可抑制细菌的毒力因子活性。变异链球菌是主要致龋菌，葡萄糖基转移酶（glucosyltransferase，GTF）是变异链球菌重要的致病因子。EGCG 可抑制葡糖基转移酶合成葡聚糖，阻碍细菌黏附形成菌斑生物膜［22］。此外，EGCG可抑制莫雷梭菌（Solobacterium moorei，S moorei）表达β⁃半乳糖苷酶基因，从而减少与口臭相关挥发性硫化物的产生［23］。牙龈素是P. gingivalis 最重要的毒力因子，参与摄取氨基酸，提供营养；促进细菌黏附共聚及菌毛成熟，形成菌斑生物膜［7，24⁃25］；降解细胞间黏附分子及多种细胞因子、补体成分，入侵宿主防御反应，最终导致牙周组织破坏［26⁃27］。研究发现EGCG 能抑制rgpA 和kgp 基因的表达，减少Rgp 和Kgp 的分泌［19］，但尚无对Rgp 和Kgp 活性的研究。本研究结果显示：低于MIC 剂量的EGCG 可显著抑制P. gingivalis 牙龈素Rgp 和Kgp 裂解特异性产色底物释放显色团P⁃硝基苯胺的水平。

宿主对牙周致病菌的免疫反应是造成牙周组织破坏的主要原因，牙周结缔组织中最主要的细胞成分为HGFs，牙周致病菌主要通过刺激HGFs分泌MMPs，破坏细胞外基质稳态，引起牙周组织 破坏［28⁃30］。研究证实EGCG 可抑制伴放线放线杆菌⁃LPS［31］及牙龈卟 啉单胞菌⁃LPS［32］诱导HGFs分泌MMPs。本实验采用P. gingivalis 直接刺激宿主HGFs 产生MMP⁃1 和MMP⁃2，在加入50 μg/mL EGCG 后，HGFs 中MMP⁃1 和MMP⁃2 的分泌及表达均下调。

日常绿茶饮品中儿茶素平均浓度为1 mg/mL［33］，EGCG 约500 μg/mL，足以抑制P. gingivalis的生长及生物膜的形成，此外，超声震动不会引起EGCG 的明显降解［34］。基于唾液的冲刷作用，难以保证EGCG 的有效抗菌浓度，50 μg/mL EGCG 仍可抑制P. gingivalis 毒力因子牙龈素，抑制P. gingiva⁃lis 诱导牙龈成纤维细胞表达MMPs。综上所述，EGCG 可作为伴全身疾病的牙周炎辅助治疗的潜在药物。本课题组后续将建立动物模型，多方面证实EGCG 的抗菌及抗炎作用，以期为牙周炎的防治提供更多依据。

【Author contributions】Qi X and Kong LX performed the experi⁃ments，analyzed the data，and wrote and revised the article. Li SJ，Ma ST，Qi YL wrote and revised the article. Zhao L designed the study，wrote and revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.