EGCG对美拉德反应产物抗氧化性能的影响

轩 滋，李 华，郭艳艳

河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001

美拉德反应又称羰氨反应，是发生在羰基化合物和氨基化合物之间的非酶褐变反应[1]。美拉德反应会产生还原酮中间体、杂环化合物和类黑素等美拉德反应产物(MRPs)，MRPs不仅对食品的色泽、香味和口味等产生有益影响，还具有很强的抗氧化能力[2-7]。但是，美拉德反应非常复杂，中间反应机制尚未完全澄清，对该反应过程及其产物利用仍需进一步研究。

食品加工过程中，多种成分间存在相互作用，从而影响产品的品质。表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是从茶叶中提取的一种儿茶素类单体，是茶多酚的主要成分。研究表明，EGCG具有抗氧化活性，可与生育酚和化学合成的丁基化羟基茴香醚(BHA)媲美[8]。EGCG还具有抗炎、降血脂、抗癌等作用，可以替代合成食品添加剂，保证食品的安全和质量。此外，EGCG能够减少美拉德反应有害产物的产生[9]。尽管EGCG在加工和储存过程中存在不稳定性，但是仍有许多食品和饮料中添加EGCG等茶多酚成分，以期延长食品的保质期和提高其抗氧化性能。

基于美拉德反应的复杂性和产物不确定性，目前研究较多的是葡萄糖-氨基酸模型[10]，张晓溪等[11]利用果糖和不同氨基酸进行美拉德反应，结果表明果糖-半胱氨酸美拉德产物的还原能力和ABTS自由基清除能力最高。此外，半胱氨酸还是面筋中的重要氨基酸，探讨EGCG对其功能的影响，也有助于面制品的研究。因此，作者选择葡萄糖-半胱氨酸模型进行试验，采用DPPH法、ABTS法和总还原能力3种测定方法，考察EGCG添加量、加热温度、加热时间、溶液pH值、羰氨物质的量比对葡萄糖-半胱氨酸美拉德反应产物的自由基清除率以及还原能力的影响，确定反应产物抗氧化能力的最适产生条件。

1 材料与方法

1.1 材料

EGCG：实验室自制(纯度90%)；L-半胱氨酸(纯度99%)、2，2-联苯基-1-苦基肼基(纯度96%)、2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(纯度98%)：上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1600B型紫外可见分光光度计：上海美谱达公司；DZKW-S-4型电热恒温水浴锅：北京光明公司； pH计：奥豪斯仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

用pH 7.4的磷酸缓冲液(PBS)制备等物质的量(0.1 mmol)的葡萄糖-半胱氨酸溶液模型，置于-20 ℃冰箱内保存备用。分别考察EGCG添加量、反应温度、加热时间、体系pH值、羰氨物质的量比等因素对模型产物抗氧化能力的影响。

1.3.2 DPPH自由基清除能力的测定

参照Mariana等[12]的方法，略作修改：移取样品25 μL与4 mL DPPH溶液(DPPH用甲醇溶解，浓度为0.05 mmol/L)，混匀后室温下避光反应30 min，于波长517 nm处测定吸光度，计算DPPH自由基清除率。平行试验重复3次。

式中：A1为25 μL样品溶液+4.0 mL DPPH工作液的吸光度；A2为25 μL样品溶液+4.0 mL甲醇的吸光度；A0为25 μL PBS+4.0 mL DPPH工作液的吸光度。

1.3.3 ABTS自由基清除能力的测定

参照Thaipong等[13]的方法，稍作修改：分别移取5 mL ABTS溶液(7 mmol/L)和过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)混合均匀，室温避光反应12～16 h得到ABTS工作液(当天使用)，然后用无水乙醇逐级稀释至吸光度为0.70±0.02(734 nm处)。移取样品10 μL与ABTS工作液12 mL，混匀后室温避光反应30 min，于波长734 nm处测定吸光度，计算ABTS自由基清除率。平行试验重复3次。

式中：A1为10 μL样品溶液+12.0 mL ABTS工作液的吸光度；A2为10 μL样品溶液+12.0 mL无水乙醇的吸光度；A0为10 μL PBS +12.0 mL ABTS工作液的吸光度。

1.3.4 总还原能力测定

取1.0 mL上述模型样品溶液于试管中，依次加入2.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6的磷酸缓冲液和2.5 mL 1% 的铁氰化钾，混匀后置于50 ℃水浴下反应20 min，冷却至室温后再加入2.5 mL 10% 的三氯乙酸，混匀，离心(3 000 r/min)10 min 后取上清液1 mL，加入3 mL 蒸馏水和0.3 mL 0.1% 的三氯化铁，摇匀后静置10 min，于波长700 nm处测定吸光度，表示样品总还原能力，其大小与吸光度成正比。平行试验重复3次。

1.4 数据处理

采用SPSS Statistics 25、Origin95对试验数据进行处理、绘图。

2 结果与分析

2.1 EGCG添加量对反应产物抗氧化性的影响

移取6组10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液，分别添加不同质量(0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg)的EGCG，140 ℃下加热1.0 h后用冰水浴冷却，测定反应产物的抗氧化能力，结果如图1所示。

图1 EGCG添加量对反应产物抗氧化能力的影响

由图1可知，EGCG的添加能够显著增强葡萄糖-半胱氨酸模型产物的DPPH自由基清除率和总还原能力(P<0.05)，这可能是因为EGCG本身具有抗氧化能力与MRPs产生了协同作用；但是对ABTS的清除率增强不显著(P>0.05)。MRPs能与ABTS+配对，导致其褪色，降低吸光度。随着EGCG添加量的增加，3种指标都呈现先升高后平缓的趋势。考虑到EGCG的成本，选择1.5 mg为EGCG的最适添加量。

2.2 加热时间对反应产物抗氧化性的影响

移取6组10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液，分别加入EGCG 1.5 mg，在140 ℃下分别加热0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后用冰水浴冷却，测定反应产物的抗氧化能力，结果如图2所示。

图2 加热时间对反应产物抗氧化能力的影响

由图2可知，未加热样品的抗氧化能力比加热0.5 h样品的高，可能是因为半胱氨酸和EGCG具有很强的抗氧化性，但是EGCG具有热不稳定性，随着加热时间延长，结构会发生变化，抗氧化性受到影响[14]。加热时间为1.0 h(1.5 h)时，样品的ABTS清除率、DPPH清除率、总还原能力分别为94.33%、89.72%、2.617 (99.61%、87.65%、2.439 )，较0.5 h时略有增加，说明样品产生较多具有很强抗氧化能力的美拉德反应后期产物——类黑精[15]。另外，EGCG的自然氧化产物C-4位与C-8″连接的EGCG二聚化合物1和B-B″环间氧化的化合物，不同反应条件(如时间、温度、pH值)下，EGCG主要自然氧化产物的结构会发生变化[16]，但仍然具有一定的抗氧化能力。总体比较而言，各时间点抗氧化性没有明显变化，这也说明样品中的抗氧化成分在反应1.0～1.5 h就能形成，且之后保持比较稳定的状态。为节约时间，选择1.0 h为最适反应时间。

2.3 加热温度对反应产物抗氧化性的影响

移取6组10 mL葡萄糖-半胱氨酸溶液，加入EGCG 1.5 mg，分别于110、120、130、140、150、160 ℃条件下加热1.0 h后用冰水浴冷却，测定反应产物的抗氧化能力，结果如图3所示。

图3 加热温度对反应产物抗氧化能力的影响

由图3可知，110～130 ℃时，随着温度的升高，3种抗氧化指标明显增加(P<0.05)，在130 ℃时，MRPs的ABTS清除率、DPPH清除率和总还原能力分别为94.25%、84.57%、2.415 ，均达到最大值。而130、140、150 ℃时的3种抗氧化指标变化不明显(P>0.05)，说明在3个温度下均产生了MRPs，而且数量基本一致，但是160 ℃时抗氧能力有下降趋势，这可能是因为高温会导致还原性物质的分解，该结果与唐杰[17]的报道一致。为减少能源消耗，选择130 ℃为最适加热温度。

2.4 pH值对反应产物抗氧化性的影响

称取6份1.5 mg EGCG、0.1 mmol的半胱氨酸和葡萄糖于10 mL瓶中，分别用pH 2.0、4.0、6.0、7.4、8.0、10.0的缓冲溶液溶解，130 ℃下加热1.0 h后用冰水浴冷却，测定反应产物的抗氧化能力，结果如图4所示。

图4 pH值对反应产物抗氧化能力的影响

美拉德反应体系的pH值能够影响美拉德反应的反应速率及阿马道里重排产物的降解路径，从而影响最终产物中化合物的种类[18]。碱性条件有利于美拉德和焦糖化反应的非酶褐变反应，而体系中酸度越高，在加热条件下加热的游离氨基酸的稳定性越高[19]。由图4可知，pH 2.0～10.0时，ABTS清除率和总还原能力呈先平缓后下降的趋势，DPPH清除率则呈现先升高再平缓后下降的趋势，MRPs的抗氧化能力在酸性条件下比在碱性条件下高。这与Martins等[20]的试验结果一致， pH 4.8～7.5时，类黑精浓度随着pH值的增加而增加。多数食品及加工条件的酸碱度为中性，因此，选择最适值pH 6.0。

2.5 羰氨物质的量比对反应产物抗氧化性的影响

称取不同物质的量比的葡萄糖-半胱氨酸(0.25∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、4∶1)，溶于10 mL缓冲液(pH 6.0)中，分别添加1.5 mg EGCG，130 ℃下加热1.0 h后用冰水浴冷却，测定反应产物的抗氧化能力，结果如图5所示。

图5 羰氨物质的量比对反应产物抗氧化能力的影响

由图5可知，随着反应体系中葡萄糖含量的增加，样品抗氧化性大致呈现先升高后降低的趋势。当羰氨物质的量比为1.5∶1时，MRPs的抗氧化性最强，其ABTS清除率、DPPH清除率和总还原能力分别为99.86%、84.49%和2.199。这可能是因为过多的氨基会发生分子内脱水缩合形成内酰胺，从而使反应体系中氨基的量减少，而葡萄糖含量过高，没有足够的氨基与羧基发生反应，在抗氧化测定时对整个体系起到了稀释作用，这与赵晶等[21]的试验结果一致。为节约成本，最大程度地利用反应底物，选择1.5∶1为最适羰氨比。

3 结论

通过ABTS清除率、DPPH清除率和总还原能力的测定，分析了EGCG参与下的不同反应条件对美拉德反应产物抗氧化能力的影响。结果表明，在EGCG添加量为1.5 mg条件下，随着羰氨物质的量比的增加和加热温度的升高，反应产物的抗氧化能力都呈现先升高后平缓(或下降)的趋势；MRPs在酸性条件下具有更好的抗氧化活性。当反应温度130 ℃、加热时间1.0 h、pH 6.0、羰氨物质的量比1.5∶1时，在EGCG添加量为1.5 mg时，MRPs具有最佳的抗氧化活性。美拉德反应为食品加工中常见的反应，该结果为进一步研究MRPs抗氧化成分、EGCG对美拉德反应的影响机理以及MRPs的综合开发利用提供了技术支持和理论指导。