美洲大蠊多肽PAP-2对肝癌血管生成、侵袭及转移能力的影响

张鸿翰，张 蕊，王 瑶，吕 鸿，吴定宇，彭 芳*

（1.大理大学药学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000；3.昆明市儿童医院，昆明 650000；4.西双版纳傣族自治州农垦医院，云南景洪 666100；5.大理大学实验室管理处，云南大理 671000）

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上第五大最常见的恶性肿瘤，在全球癌症死亡率中排名第二〔1-2〕，具有高恶性、高复发率和易转移的特点。近年来，许多研究集中于肿瘤血管生成〔3-5〕，肿瘤血管生成是与肿瘤微环境有关的重要生物学过程之一〔6〕。HCC是一种典型的血管丰富且恶性程度极高的肿瘤，血管生成在HCC 生长中所起的作用最为突出〔7〕。现阶段研究表明HCC 的发生与发展是一个多步骤参与、多因素形成的过程，HCC 的侵袭和转移与肝癌血管生成存在极为密切的关系〔8-11〕。

在肿瘤治疗中，多肽具有一定的优势，多肽类药物适应症比小分子化合物广泛，疗效更为显著，分子认知性更为优良，代谢毒性相对较低。另外，多肽类药物的稳定性和纯度高于蛋白质药物，合成成本也相对较低，几乎不存在免疫原性〔12〕。同时针对性强，研发目标清晰，开发率高等也是多肽类药物表现出的明显优势〔13〕。

美洲大蠊入药始载于《神农本草》〔14〕中。本研究团队自1970 年以来就对美洲大蠊进行了系列研究，先后研发了系列源自美洲大蠊的药物，如用于烧伤、烫伤的康复新液，治疗急、慢性心力衰竭的心脉隆注射液和治疗乙型肝炎的肝龙胶囊〔15-18〕。

本研究团队的前期研究已明确美洲大蠊多肽的前体物CⅡ-3和脱脂膏的抗HCC作用〔12，19〕，但它们提取率低、成本高，并且口服给药时实验动物依从性低。为了克服这些不足，本课题组从CⅡ-3中分离并鉴定出13 种肽分子，命名为PAP 系列多肽（PAP1～PAP13）。课题组前期对PAP-1、PAP-2和PAP-3作为实验药物进行了研究〔12，19-22〕，发现美洲大蠊多肽对HCC微环境的调节可能与下调氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的水平有关。在血管生成方面，美洲大蠊多肽可抑制HepG2细胞和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的增殖与迁移，减少两种细胞之间的黏附和HUVEC 的小管形成，下调VEGF 的表达，其中，多肽PAP-2效果更好〔12，19-22〕。因此，为深化前期的研究，本实验以美洲大蠊多肽PAP-2为实验药物，采用H22肝癌细胞在Balb∕c 小鼠腋下建立荷瘤移植模型，分析PAP-2 对碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、转化生长因子-β（TGF-β）、金属基质蛋白酶-9（MMP-9）和CD34的影响，比较PAP-2在体内与CⅡ-3和脱脂膏抗HCC的优劣性，为美洲大蠊多肽的进一步应用提供更有力的支撑和基础。

1 材料

1.1 药物、细胞及实验动物美洲大蠊多肽PAP-2（PF-20160513-02，纯度98.057%）、美洲大蠊提取物CⅡ-3、美洲大蠊脱脂膏均由大理大学昆虫生物医药研究院巫秀美博士和张成桂博士提供。

肝癌H22腹水细胞株，由大理大学药学院药理学教研室刘晓波副教授馈赠。

SPF 级Balb∕c 小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，购于昆明楚商科技有限公司，动物合格证号：43004700028293，实验动物饲养于大理大学实验动物中心IVC屏障系统内。

1.2 试剂与仪器RPMI-1640培养基、胎牛血清培养基（美国Gibco 公司）；青霉素和链霉素混合物、0.25%胰蛋白酶-EDTA、二甲基亚砜（北京索莱宝公司）；5-氟尿嘧啶（5-FU，国药控股化学试剂有限公司）；实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time qPCR）试剂盒（美国GeneCopoeia＆Inc 公司）；引物由广州iGene 生物技术有限公司设计；免疫组织化学染色（IHC）的一抗、二抗及试剂盒（美国ABclonal Biotechnology公司）；酶联免疫吸附实验（ELISA）试剂盒（南京建城生物工程有限公司）。

二级生物安全柜（苏州安泰空气技术有限公司）；CO2培养箱（美国NUAIRE 公司）；MOTIC 倒置显微镜（新加坡SPEED FAIR 公司）；台式低速离心机（北京时代北利离心机有限公司）；超级纯水机（格力电器中山制造有限公司）；自动脱水机、连续切片机（美国Leica 公司）；生物组织包埋机（中国孝感市宏业医用仪器有限公司）。

2 方法

2.1 美洲大蠊各提取物的制备美洲大蠊脱脂膏的制备：将美洲大蠊全虫干燥后进行粉碎，用70%乙醇冷浸提取3次，将所得乙醇液进行合并、浓缩、提取获得浸膏，浸膏到脱脂膏的平均收得率为75.18%。美洲大蠊提取物CⅡ-3 的制备：将美洲大蠊脱脂膏上聚酰胺柱，依次应用水及不同比例的含水甲醇洗脱，定量收集，分别浓缩，冷冻干燥后即为所用样品，提取物占生药的比率为0.2%。美洲大蠊多肽PAP-2用注射用水配置成浓度为1 g∕L 的母液于4 ℃保存，实验时用培养基将药物稀释到所需浓度即可。

2.2 H22荷瘤模型小鼠的建立移植原代H22肝癌细胞于小鼠腹腔并传代7 d，无菌抽取第2代小鼠腹水，以0.9%氯化钠溶液稀释，0.4%台盼蓝计数，当细胞活力＞95%后，取细胞密度为1×107个∕mL 的细胞悬液0.4 mL，于小鼠右腋窝处接种，当小鼠腋窝处出现明显瘤组织时即造模成功。

2.3 分组与给药将造模成功的100 只小鼠随即分为10 组，每组10 只（雌雄各半），分别为模型组（0.9%氯化钠溶液）、5-FU 组（阳性对照药物，20 mg∕kg）、PAP-2 低剂量组（50 mg∕kg）、PAP-2 中剂量组（100 mg∕kg）、PAP-2 高剂量组（200 mg∕kg）、PAP-2 和5-FU 联用低剂量组（50 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、PAP-2 和5-FU 联用中剂量组（100 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、PAP-2 和5-FU 联用高剂量组（200 mg∕kg PAP-2 和20 mg∕kg 5-FU）、CⅡ-3 组（200 mg∕kg CⅡ-3）、脱脂膏组（200 mg∕kg脱脂膏）。每只小鼠称重后给药，给药容量为0.1 mL∕10 g。分组当天定义为D0 天，并于D0 天开始给药，其中，阳性药5-FU 隔天腹腔注射1 次；0.9%氯化钠溶液、PAP-2、CⅡ-3 和脱脂膏灌胃给药，每天给药1 次，均连续给药10 d。在D10 天对所有小鼠安乐死处理，取材。

2.4 瘤质量及脏器指数的测定小鼠末次给药24 h后，眼内眦取血，然后脱颈处死，剥取瘤块及脏器（脾、胸腺和肝），按下列公式计算抑瘤率及脏器指数：抑瘤率（%）=（模型组小鼠平均瘤质量－实验组小鼠平均瘤质量）∕模型组小鼠平均瘤质量×100%；脏器指数=脏器（脾、胸腺和肝）质量（mg）∕体质量（g）。

2.5 苏木精-伊红（HE）染色10%中性福尔马林液固定肝组织，进行脱水、包埋、切片（厚度4 μm），进行HE 染色，染色后于倒置显微镜下观察标本病理学改变。

2.6 ELISA 法检测bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量小鼠眼内眦取血后，将全血于4 ℃环境下放置2 h，然后在4 ℃条件下以4 000 r∕min离心15 min，吸取上清，置于-20 ℃保存，备用。采用ELISA 法测定各组小鼠血清中bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34的含量。

2.7 Real-time qPCR 法检测bFGF、TGF-β、MMP-9的mRNA 表达依照All-in-OneTMFirst-cDNA Synthesis Kit 试剂盒和All-in-OneTMqPCR Mix试剂盒说明书上的步骤进行Real-time qPCR 反应，各引物序列见表1，将反应液加入PCR 管中，设置的扩增程序为95 ℃、10 min，1个循环；95 ℃、10 s，60 ℃、20 s，40个循环；95 ℃、15 s；60 ℃、60 s；95 ℃、15 s。分析反应板数据，从而获得每个样品反应的Ct值，与模型组比较后，取2-ΔΔCt值进行数据统计。

2.8 IHC 法检测bFGF、TGF-β、MMP-9 和CD34 的表达将“2.5”中包埋好的组织切片，置于70 ℃恒温箱中烤片0.5 h。检测时二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱二甲苯，柠檬酸抗原修复，3%过氧化氢阻断、灭活内源性过氧化物酶，5%脱脂奶粉封闭，磷酸盐缓冲溶液（PBS）洗脱后滴加bFGF（1：400）、TGF-β（1：400）、MMP-9（1：50）和CD34（1：300）的一抗，4 ℃孵育过夜，次日室温复温30 min，弃一抗，PBS冲洗3 次，每次5 min。再加二抗（1：200），室温孵育30 min，弃二抗，PBS 冲洗3 次，每次3 min。DAB 反应染色10 min，苏木素复染，干燥，封片。用Image-Pro Plus 6.0测量阳性表达的吸光度（A）值。

2.9 统计学分析采用SPSS 16.0 统计分析软件进行分析，数据以（±s）表示。组间比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 Real-time qPCR引物序列表

3 结果

3.1 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠瘤块质量的影响与模型组相比，其余各给药组均在不同程度上对H22荷瘤小鼠肿瘤有抑制作用，且PAP-2 各剂量组与PAP-2 和5-FU 联用各剂量组对肿瘤的抑制作用呈现一定的剂量依赖性。PAP-2 中、高剂量组与PAP-2 和5-FU 联用中、高剂量组对肿瘤抑制作用均优于CⅡ-3组和脱脂膏组（P＜0.05）。见表2。

表2 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠瘤块质量的影响（xˉ± s,n = 10）

3.2 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响与模型组相比，5-FU 组脾脏指数和肝脏指数均显著降低，说明5-FU对小鼠的脏器有一定损伤作用。与5-FU 组相比，其余各给药组胸腺指数（PAP-2和5-FU联用高剂量组及CⅡ-3组除外）、脾脏指数和肝脏指数都高于5-FU 组（P＜0.05），提示PAP-2对免疫器官有一定保护作用。见表3。

表3 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠脏器指数的影响（xˉ± s,n = 10）

3.3 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织形态学的影响经HE 染色后镜下观察，可见瘤组织呈现巢状或片状生长，肿瘤细胞排列紧密，细胞大小不一、形态各异，异形明显，核大深染，易见核分裂相、并见病理性核分裂。模型组染色较深，坏死面积较小。与模型组相比，其余各组染色相对较浅，呈现不同程度的坏死，肿瘤组织坏死面积相对较大。提示经美洲大蠊多肽PAP-2 及美洲大蠊提取物CⅡ-3 和脱脂膏处理后，肿瘤组织的恶性程度减轻，肿瘤组织的侵袭能力减弱。见图1。

图1 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织形态学的影响（倒置显微镜，×100）

3.4 ELISA 检测美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠血清 中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 的影 响与模型组相比，其余各组小鼠血清中bFGF 含量明显减少，说明PAP-2 能够降低血清中bFGF 含量；CⅡ-3 组和脱脂膏组在一定程度上下调了血清中CD34 的含量；PAP-2 中剂量组降低了血清中MMP-9的含量；5-FU组、PAP-2高剂量组、CⅡ-3组和脱脂膏组在一定程度上下调了小鼠血清中TGF-β的含量（P＜0.05）。与5-FU组相比，PAP-2中、高剂量组下调血清中CD34作用不如5-FU组（P＜0.05），其余各组差异无统计学意义，血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β含量相差不大。见表4。

3.5 IHC 分析美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的影响

3.5.1 美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF 蛋白的影响 IHC 结果见图2，棕色的细胞为阳性，即bFGF 蛋白表达，颜色的深浅与蛋白表达量多少成正比。从图2 可观察到，模型组染色较深，bFGF 蛋白表达较多，与模型组相比，其余各给药组棕色有不同程度变浅，说明bFGF 蛋白表达有不同程度的下降。

表4 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34、MMP-9和TGF-β的影响（xˉ±s,n=10,ng∕mL）

图2 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF蛋白表达的影响（倒置显微镜，×400）

经分析数据结果显示，与模型组相比，阳性药5-FU 处理后，肿瘤组织中bFGF 平均光密度值降低显著，说明5-FU能下调肿瘤组织中bFGF表达，其余各给药组（除PAP-2低剂量组、CⅡ-3组和脱脂膏组外）中bFGF 表达均呈现不同程度的下降，且5-FU组作用优于PAP-2 各剂量组、CⅡ-3 组和脱脂膏组，PAP-2 中、高剂量组下调肿瘤组织中bFGF 蛋白表达的作用优于CⅡ-3 组和脱脂膏组，PAP-2和5-FU 联用低剂量组对肿瘤组织中bFGF 蛋白的下调作用优于PAP-2低剂量组（P＜0.05）。见表5。

表5 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中相关蛋白表达的影响（平均光密度，xˉ± s，n = 10）

3.5.2 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中CD34蛋白的影响 IHC结果见图3，棕色的细胞为阳性，即CD34蛋白表达，颜色的深浅代表蛋白表达量的多少。从图3可观察到，模型组染色较深，CD34蛋白表达较多，与模型组相比，其余各给药组棕色有不同程度变浅，说明CD34蛋白表达有不同程度的下降。

由表5 可知，与模型组相比，阳性药5-FU 作用后，肿瘤组织中CD34 光密度值降低明显，说明5-FU 能明显下调肿瘤组织中CD34 表达，其余各给药组中CD34 表达均呈现不同程度的下降，且5-FU组对肿瘤组织中CD34 的下调作用优于PAP-2 各剂量组、CⅡ-3 组和脱脂膏组，PAP-2 中、高剂量组降低肿瘤组织中CD34 蛋白作用优于CⅡ-3 组和脱脂膏组（P＜0.05）。

3.5.3 美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中MMP-9 蛋白的影响 IHC 结果见图4，染为棕色的细胞为阳性，即MMP-9 蛋白表达，颜色的深浅代表蛋白表达量的多少。从图4 可以观察到，模型组染色细胞较多、染色较深，表明MMP-9 蛋白表达较多，与模型组相比，其余各给药组棕色有不同程度变浅，说明MMP-9 蛋白表达有不同程度的下降。

图4 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中MMP-9蛋白的影响（倒置显微镜，×400）

从表5 可知，与模型组相比，阳性药5-FU 处理后，肿瘤组织中MMP-9 光密度值降低明显，说明5-FU 能下调肿瘤组织中MMP-9 蛋白表达，其余各给药组中MMP-9 表达均呈现不同程度的下降，提示美洲大蠊多肽PAP-2 和美洲大蠊提取物CII-3 和脱脂膏能够下调肿瘤组织中MMP-9 蛋白的表达，且5-FU 作用优于CII-3 和脱脂膏，PAP-2 作用优于CⅡ-3和脱脂膏（P＜0.05）。

3.5.4 美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中TGF-β蛋白的影响 IHC 结果见图5，棕色的细胞表示阳性，即代表TGF-β蛋白的表达，颜色的深浅代表蛋白表达量的多少。从图5 可以观察到，模型组棕色细胞较多、棕色较深，说明TGF-β蛋白表达相对较多，与模型组相比，其余各给药组棕色有不同程度变浅，显示TGF-β蛋白表达有不同程度的下降。

从表5 可知，与模型组相比，阳性药5-FU 处理后，肿瘤组织中TGF-β光密度值降低显著，说明5-FU 能明显下调肿瘤组织中TGF-β蛋白表达，其余各给药组中TGF-β表达均呈现不同程度的下降，PAP-2 下调肿瘤组织中TGF-β蛋白表达作用优于CⅡ-3和脱脂膏，PAP-2和5-FU联用中剂量组下调肿瘤组织中TGF-β蛋白表达作用优于PAP-2 中剂量组（P＜0.05）。

图5 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中TGF-β蛋白的影响（倒置显微镜，×400）

3.6 Real-time qPCR 测定美洲大蠊多肽PAP-2 对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA 的影响与模型组相比，5-FU 组，PAP-2 中、高剂量组，PAP-2 和5-FU 联用中、高剂量组均对荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF mRNA 呈现上调趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），其中5-FU组上调作用最明显，而CⅡ-3 组荷瘤小鼠肿瘤组织的bFGF mRNA 的表达有所下调（P＜0.05）。与模型组比较，5-FU 组，PAP-2低、中剂量组，PAP-2和5-FU联用低、中剂量组，CII-3 组和脱脂膏组都能从不同程度上调荷瘤小鼠肿瘤组织中MMP-9 mRNA 的表达，差异有统计学意义（P＜0.05），PAP-2 对MMP-9 mRNA 表达的上调作用与PAP-2 的剂量呈负相关。与模型组相比，PAP-2低、中剂量组，PAP-2和5-FU联用高剂量组都能上调荷瘤小鼠肿瘤组织中TGFβmRNA 的表达，差异有统计学意义（P＜0.05），其中PAP-2 低剂量组的上调作用相对较优，而PAP-2高剂量组荷瘤小鼠肿瘤组织中TGF-βmRNA 的表达有所下调（P＜0.05）。见表6。

表6 美洲大蠊多肽PAP-2对H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF mRNA、MMP-9 mRNA和TGF-β mRNA的影响（xˉ± s，n = 10）

4 讨论

HCC 微环境是由细胞成分、肝癌细胞、其余多类除肝细胞外互相作用的细胞和非细胞成分细胞外基质组成的复杂的肝癌产生、发展和迁移的内环境〔23〕。在正常的生理条件下，肝癌微环境由于组织和器官的自我稳定性而处于动态平衡。然而，在癌症的早期，各种肿瘤促进因子在打破肝癌微环境的原始平衡中起作用，导致微环境向肝癌的有利方向发展。

本研究发现PAP-2 对肿瘤有抑制作用，而且抗肿瘤作用是剂量依赖性的，剂量越高，抗肿瘤效果越好，且效果优于CⅡ-3 和脱脂膏（P＜0.05）。PAP-2 对器官损伤有一定的保护作用。 ELISA 结果表明，PAP-2 只能下调H22荷瘤小鼠血清中bFGF的含量。荷瘤小鼠血清中bFGF、CD34 和TGF-β的含量在PAP-2、CⅡ-3 和脱脂膏的作用下差异无统计学意义。IHC 结果表明，PAP-2 可以降低H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表达。此外，PAP-2 在抑制小鼠肿瘤组织中CD34、MMP-9 和TGF-β 蛋白的表达方面较优。ELISA 和IHC 共同表明，PAP-2 在抑制肿瘤组织中的bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β的表达以及肝癌的血管生成和侵袭转移方面的作用优于CⅡ-3 和脱脂膏。

Real-time qPCR 结果显示，PAP-2 可以上调H22荷瘤小鼠肿瘤组织中bFGF、MMP-9 和TGF-β的mRNA 表达。qPCR 实验的某些结果与IHC 的结果相反。该结果的可能性如下：动物体内，药物的代谢是一个极其复杂的过程，再加上诸如肝癌等可变的肿瘤环境，其中的过程和最终结果是不可预测的。 PAP-2 是从CⅡ-3 中提取的一种多肽单体，尚不清楚其对肝癌的特异性作用位点和作用机理。实验测量的这些指标在肝癌的血管生成、侵袭和转移过程中会相互影响，并且某些指标同时处于肝癌的早期和晚期。有相反的效果，具体原因仍不清楚。

总之，从该实验中可以看出，PAP-2 可以抑制荷瘤小鼠H22的肿瘤生长，这可能与bFGF、CD34、MMP-9 和TGF-β蛋白表达下调有关。这些因子与肝癌的血管生成、侵袭和转移密切相关，因此PAP-2 的作用机制可能是抑制肝癌的血管生成、侵袭和转移。

综上所述，美洲大蠊多肽PAP-2 对肝癌的血管生成、侵袭和转移的影响优于CⅡ-3和脱脂膏，表明PAP-2具有继续研究的意义和价值。对于PAP-2上调肿瘤组织中bFGF、MMP-9 和TGF-βmRNA 表达的结果，可为下一步该组动物实验提供参考和启示，具体原因有待进一步研究和探索。同时，这也表明影响肝癌血管生成的因素并不十分局限，无法在本研究中提及，正在等待更多的研究人员发现和探索。