金针菇菌渣饲料中添加纤维素酶及甘露寡糖对草鱼生长、肠道结构及血清生理生化指标的影响

朱 波 赵青海 钟 蕾 胡 毅*

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南长沙410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德415000）

金针菇菌渣是收集金针菇子实体后废弃的培养基基质，其中含有多种必需氨基酸、大量未分解的纤维素及部分子实体残体。据中国食用菌协会统计，2018 年全国金针菇产量为257.6 万吨，按菌渣量为子实体产量的25%～33%计算[1]，金针菇菌渣年产量将达64.4万吨以上。将金针菇菌渣应用于水产饲料，不仅能减少资源浪费，还可降低养殖成本。但现有研究表明饲料中高含量的金针菇菌渣可能会抑制动物生长，降低饲料表观消化率，影响机体抗氧化性能[2-3]。因此需寻求适宜的途径以提高金针菇菌渣的添加量。纤维素酶来源广泛，从细菌或真菌中均可提取，它可破坏纤维素结构从而提高动物对粗纤维饲料的消化率。纤维素酶能提高草鱼[4]摄食率，改善大西洋鲑[5]后肠形态，增强动物非特异性免疫力[6]。甘露寡糖可从酵母细胞壁中提取，作为一种免疫增强剂，可改善水产动物肠道消化功能，提高增重率[7-9]。甘露寡糖还可增强动物免疫性能，提高抗应激能力，降低头肾组织炎症反应[10-13]。因此本实验以我国淡水人工养殖产量最大的草鱼为研究对象，在草鱼高金针菇菌渣饲料中添加纤维素酶及甘露寡糖喂养草鱼，通过研究草鱼生长性能、肠道结构、血清生化指标的变化。以期提高金针菇菌渣在水产动物配合饲料中的应用效果。

1 材料与方法

1.1 实验材料与配方

实验所用纤维素酶(Cellulase，活性为20 000 U/g)、甘露寡糖（Mannose oligosaccharide，MOS）购自青岛玛斯特生物技术有限公司。以商品饲料作为空白对照组饲料（Ⅰ组），在空白对照组饲料中添加15%的金针菇菌渣配制对照组饲料（Ⅱ组），在对照组饲料中分别添加0.05%的纤维素酶（Ⅲ组）、0.05%的甘露寡糖（Ⅳ组）配制2组实验饲料，共配制成4组等氮等脂实验饲料。饲料组成及营养水平见表1。

1.2 实验鱼与养殖管理

养殖实验于湖南省娄底市新化县车田江水库的聚乙烯网箱（1.5 m×1.5 m×1.5 m）中进行。鱼苗购自湖南省湘潭市某苗种场，鱼苗购入后于水库网箱暂养一个月，以适应养殖环境。每组设置3 个重复网箱，每个网箱随机挑选40 尾规格一致，均重为（20.01±0.05）g 的草鱼。养殖实验持续56 d，每天投喂3 次（07：00，12：00，17：00），投饵率为体重的3%～5%。养殖期间水温26.0～31.5 ℃，水体溶氧（6.8±0.5）mg/L，氨氮≤0.21 mg/L。

表1 实验饲料组成及营养水平（风干基础，%）

1.3 样品采集

采样前，实验鱼预先饥饿24 h。实验开始及结果分别称量每个网箱草鱼的总重量，记录总尾数，用以计算增重率、饲料系数、存活率。实验结束后每个实验箱随机取3尾草鱼麻醉后于冰盘上迅速解剖，称取个体重、肝重、肠重用于计算肝体比、肠体比；每个网箱随机选取3 尾草鱼，解剖后取中肠，使用多聚甲醛溶液固定，用于制作肠道组织切片；每个网箱随机取4 尾草鱼，取中肠，装于1.5 mL 无酶管，-80 ℃保存用以测定肠道消化酶活性。每个网箱随机取6尾草鱼，使用丁香油麻醉后从尾静脉取血，装于1.5 mL离心管中，在4 ℃下静置12 h 后，于离心机3 000 r/min 离心10 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱待测。

1.4 指标测定

1.4.1 生长指标测定

生长指标计算参照朱波等[3]公式计算。

存活率（survival rate，%）=100×Ne/Ns

饲料系数（diet conversion rate）=Wr/（We-Ws+Wd）

增重率（weight gain rate，%）=100×（Wea-Wsa）/Wsa

肥满度（condition factor，g/cm3）=Wb/L3

肝体比（hepatosmatic index，%）=100×Wl/Wb

肠体比（viserosomatic index，%）=100×Wc/Wb

式中：Ne——每箱草鱼终末尾数(尾)；

Ns——每箱初始尾数(尾)；

Wr——摄入饲料总量(g)；

We——每箱终末总重(g)；

Ws——初始总重(g)；

Wd——每箱死亡个体重(g)；

Wea——每箱终末均重(g)；

Wsa——初始均重(g)；

Wb——采样个体重(g)；

L——采样个体长(cm)；

Wl——采样个体肝重(g)；

Wc——采样个体肠重(g)。

1.4.2 肠道消化酶活性测定、肠道结构观察

肠道样品在测定前于冰盒中解冻，称重。待测组织用生理盐水进行匀浆，2 500 r/min 离心10 min，取上清液测定总蛋白含量（Total protein），淀粉酶（Amy⁃lase）、脂肪酶（Lipase）活性。另称取肠道组织样用胰蛋白酶匀浆液进行匀浆，2 500 r/min 离心10 min，取上清液测定胰蛋白酶（Trypsin）活性。消化酶试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

使用光学显微镜观察草鱼中肠组织结构，于100倍下测定绒毛高度、肌层厚度；于400 倍下进行杯状细胞计数。

1.4.3 血清生化与免疫指标测定

血清补体C3、C4、免疫球蛋白M含量采用酶联免疫吸附法测定，所用试剂购自浙江伊利康生物技术有限公司。其余血清生化指标均采用南京建成生物工程研究所的相应试剂盒测定。

1.5 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 2016和SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），用Duncan's 多重法比较组间差异性，当P＜0.05 时表示差异显著，数据表示为“平均值±标准误”。

2 结果

2.1 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼生长和形体指标的影响（见表2）

表2 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼生长及形体指标的影响（n=3）

由表2可知，与Ⅰ组比较，Ⅱ组草鱼增重率及饲料系数无显著差异（P＞0.05）；Ⅲ组及Ⅳ组增重率均显著高于Ⅱ组及Ⅰ组（P＜0.05）。而草鱼存活率、饲料系数、肥满度、肝体比及肠体比，各组间没有显著差异（P＞0.05）。

2.2 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼肠道消化酶活性的影响（见表3）

表3 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼肠道消化酶活性的影响（n=3）

由表3可知，Ⅱ组草鱼肠道淀粉酶及脂肪酶活性显著低于Ⅰ组(P＜0.05)。Ⅲ组草鱼肠道淀粉酶及胰蛋白酶活性显著高于Ⅱ组及Ⅰ组(P＜0.05)。Ⅳ组草鱼肠道淀粉酶、脂肪酶及胰蛋白酶活性显著高于Ⅱ组及Ⅰ组(P＜0.05)。

2.3 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼中肠组织结构的影响（见表4、图1）

由表4可知，Ⅱ组草鱼中肠肌层厚度显著大于Ⅰ组（P＜0.05），Ⅲ组及Ⅳ组中肠肌层厚度与Ⅱ组没有显著差异（P＞0.05），但均显著大于Ⅰ组（P＜0.05）。Ⅲ组肠道绒毛高度及杯状细胞数目显著高于Ⅱ组及Ⅰ组（P＜0.05）。Ⅳ组杯状细胞数目显著多于Ⅱ组及Ⅰ组（P＜0.05）。

表4 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼肠道结构的影响（n=3）

由图1 可知，与Ⅰ组比较，Ⅱ组草鱼中肠绒毛密度减小，肠绒毛结构受损；而与Ⅱ组相比，Ⅲ组及Ⅳ组草鱼肠道绒毛密度增大，肠道绒毛杯状细胞数目显著增加，Ⅲ组绒毛高度显著增加。两组添加剂均可一定程度促进肠道发育。

2.4 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清生化指标的影响（见表5）

由表5 可知，Ⅱ组草鱼血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性，总胆汁酸含量显著高于Ⅰ组（P＜0.05）；Ⅲ组及Ⅳ组草鱼血清尿素氮含量显著低于Ⅱ组及Ⅰ组（P＜0.05）；Ⅳ组谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性、总胆汁酸、总胆固醇含量显著低于Ⅱ组（P＜0.05）。而Ⅲ组谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性、总胆汁酸、总胆固醇及三酰甘油含量与Ⅱ组没有显著差异（P＞0.05）。

2.5 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清免疫及抗氧化功能的影响（见表6）

由表6 可知。Ⅱ组草鱼血清补体3、免疫球蛋白M、抗超氧阴离子含量显著低于Ⅰ组（P＜0.05），丙二醛含量显著高于Ⅰ组（P＜0.05）。Ⅲ组及Ⅳ组补体3、免疫球蛋白M含量显著高于Ⅱ组（P＜0.05），超氧化物歧化酶活性及抗超氧阴离子含量显著低于Ⅱ组（P＜0.05）。Ⅳ组丙二醛含量显著低于Ⅱ组（P＜0.05）。

图1 草鱼中肠组织切片图

表5 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清生理生化指标的影响（n=3）

表6 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清免疫及抗氧化指标的影响（n=3）

3 讨论

3.1 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼生长与肠道组织结构的影响

生长性能是水产动物人工养殖最直观有效的评价指标之一。水产动物对饲料营养的吸收主要在肠道进行，肠道的消化功能直接影响水产动物生长。在本实验中，添加金针菇菌渣对草鱼增重率没有显著影响，但降低了草鱼肠道淀粉酶及脂肪酶活性。而在金针菇菌渣饲料中添加纤维素酶或甘露寡糖均可提高草鱼增重率。与增重率变化相适应的是两种添加剂均提高了草鱼肠道淀粉酶及胰蛋白酶活性，消化酶活性甚至高于空白对照组水平。纤维素酶能提高草鱼增重率可能与金针菇菌渣具有较高水平的粗纤维有关[14]。纤维素构成的植物细胞壁阻碍了肠道对饲料的消化，导致对照组草鱼肠道消化酶活性下降，而添加纤维素酶可裂解细胞壁[15]，提高饲料中植物原料的利用率。有研究报道，饲料中添加纤维素酶能提高大西洋鲑鱼生长性能[5]，还可提高虹鳟鱼对饲料营养元素的表观消化率[16]。添加甘露寡糖可提高草鱼增重率与在克氏原螯虾[8]及虹鳟[10]的研究结果一致。甘露寡糖可通过调节肠道黏膜菌群结构以消除病原菌[17]，维护肠道菌群的平衡发展，进而改善机体健康，促进生长性能[18]。还有研究得出甘露寡糖可增加欧洲鲈肠道黏膜细胞数目[19]而不影响后肠褶皱长度与宽度[20]。本实验中，添加金针菇菌渣使草鱼肠道肌层厚度上升，可能是饲料粗纤维水平提高，促进消化道蠕动，导致肠道肌层厚度适应性增加。杯状细胞能分泌黏蛋白[21]，形成黏膜屏障以保护肠道[22]，肠绒毛是吸收营养的主要结构，添加纤维素酶及甘露寡糖可增加草鱼中肠杯状细胞数目，添加纤维素酶可提高肠道绒毛高度，这可能也是草鱼生长性能提高的原因之一。

3.2 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清生化指标的影响

转氨酶参与肝脏中氨基酸代谢，总胆汁酸是三酰甘油代谢产物，他们在血清中的含量可作为肝脏结构及代谢障碍的参考指标。从本实验的结果来看，对照组草鱼血清谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性及总胆汁酸含量相比于空白对照组显著增加，金针菇菌渣饲料可能影响了草鱼肝组织结构或代谢功能，而在金针菇菌渣中添加甘露寡糖可显著降低草鱼血清谷草转氨酶活性及总胆汁酸含量，甘露寡糖具有改善肝组织结构与功能的作用。有研究得出甘露寡糖可提高虹鳟肝脏免疫蛋白HAPT、SAA和LECT2基因表达水平[11]，也能在嗜水气单胞菌感染异育银鲫后，提高鱼体肝脏应激蛋白HSP70 的基因表达水平[23]。尿素氮是蛋白质代谢产物，在肝脏产生经由肾脏排出。血清尿素氮含量与摄入蛋白质的数量和质量有关[24]，可反映机体对蛋白质的代谢率。血清尿素氮含量降低，说明机体对蛋白质的利用率提高，增加了氮的沉积率[2]。纤维素酶组及甘露寡糖组草鱼血清尿素氮含量降低，说明纤维素酶及甘露寡糖可提高草鱼氮沉积率，改善肾脏功能。三酰甘油及总胆固醇是血清主要脂类[25]。从本实验的结果来看，甘露寡糖可以显著降低草鱼血清总胆固醇含量，三酰甘油含量也有一定程度的降低，这与在大菱鲆[26]中的研究得到的结果一致。甘露寡糖具有提高草鱼脂肪代谢的作用，草鱼肠道脂肪酶活性的提高验证了这一点。

3.3 纤维素酶及甘露寡糖对草鱼血清免疫及抗氧化指标的影响

补体广泛分布于动物体液及细胞表面，可介导免疫和炎症反应，通过改变吞噬细胞和病原细胞表面分子构象消除抗原。IgM 具有强大的杀菌、激活补体、免疫调理作用。本实验中，对照组草鱼血清C3及IgM含量显著低于空白对照组，这可能是金针菇菌渣中的黄曲霉毒素等物质影响草鱼健康，改变了血清免疫物质含量[14]，而在金针菇菌渣中添加纤维素酶或甘露寡糖均可显著增加血清C3 及IgM 的含量。有研究得出甘露寡糖可提高线鳢血清免疫球蛋白含量及溶菌酶活性，进而提高鱼体免疫力[12]。而纤维素酶提高了草鱼对饲料营养的利用率，间接提高了草鱼免疫应答能力，促进了相关免疫因子的合成。SOD、ASAFR 可清除活性氧自由基，MDA是脂质氧化产物。本实验中，对照组与空白对照组相比，草鱼血清MDA 含量显著上升，机体脂质氧化程度增加，而血清抗氧化物质ASAFR 含量却减少，草鱼抗氧化能力下降，这可能与高含量金针菇菌渣中一些霉菌毒素的累积有关[14]；而在金针菇菌渣中添加甘露寡糖后，草鱼血清MDA 含量显著下降，膜脂氧化程度降低。甘露寡糖可调节水产动物肠黏膜屏障，刺激局部和全身免疫系统，增强机体抗菌能力，促进非特异性免疫反应[27-29]，是良好的免疫增强剂。甘露寡糖还可清除机体内的活性氧，保护细胞免受氧自由基的攻击，而氧自由基的减少可能是超氧化物歧化酶活性及抗超氧阴离子含量下降的原因之一。添加纤维素酶后草鱼血清SOD 活性、ASAFR 含量显著下降，而MDA 含量与对照组没有显著差异，原因可能是在水产动物饲料中纤维素酶的添加量超过适宜范围后，会对水产动物非特异性免疫产生负面作用[6，30]。

4 结论

①饲料中添加15%的金针菇菌渣会影响草鱼肝脏、肠道组织结构与功能，降低抗氧化性能。

②在金针菇菌渣饲料中添加0.05%的纤维素酶可提高草鱼增重率，改善肠道结构与功能；而添加0.05%的甘露寡糖可以提高草鱼增重率，增强肠道消化酶活性，提高机体非特异性免疫力。添加纤维素酶或甘露寡糖可促进金针菇菌渣在草鱼饲料中的应用。