新型硅酸钙基生物材料用于根尖倒充填的封闭性能和粘接强度的研究

张俊领 何 露 刘明飨 王宏媛 李 红

目前牙髓病和根尖周病的主要且有效的治疗手段是根管治疗术。对于一些根管治疗失败或者无法进行根管再治疗的患牙，如完整的桩冠修复体、难以取出的根管分离器械、根尖外的超充材料、无法修补的根管侧穿、严重的根管解剖变异等[1]，可采用显微根尖手术的方法来保存患牙，而根尖手术过程中使用的根尖倒充填材料的封闭性能和机械强度对根尖手术成功率至关重要，良好的封闭性和粘接性可以获得有效的根尖屏障，杜绝再感染的发生。

iRoot BP Plus 和MTA(三氧化矿物凝聚体)是目前临床上两种新型的用于根尖倒充填的生物材料，为深入观察和比较这两种新型硅酸钙基生物相容性倒充填材料的根尖封闭性能和粘接强度，本研究利用离体牙，以传统倒充填材料玻璃离子GIC为对照组，模拟临床根尖手术的倒充填操作过程，采用薄片推出实验、染色渗透法和利用扫描电镜，观察和比较这两种新型倒充填材料的根尖封闭性能以及与牙体组织间的粘接强度，为倒充填材料在临床的应用和选择上提供实验依据。

1.材料和方法

1.1 实验材料和器械 高速涡轮手机、口腔显微镜(苏州速迈医疗设备有限公司，中国)、M3-PRO 机用根管锉(常州益锐医疗器械有限公司，中国)、牙胶尖(舒尔齿科有限公司，韩国)、iRoot BP Plus(Innovative BioCeramix Inc，加拿大)、MTA(Dentsply，美国)、Fuji Ⅸ玻璃离子水门汀(GC 公司，日本)、低速切割机(BUEHLER，美国)、电子显微镜(Phenom World BV,荷兰)、体视显微镜(OLYMPUS，日本)、万能测试机(SHIMADZU，日本)，Image J 科学图像处理软件、印度墨水(北京索莱宝科技有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 样本收集 收集我院颌面外科因正畸原因或牙周病新鲜拔除的下颌双尖牙93 颗，去除牙周膜及其余附着物，浸泡于0.9%生理盐水，冰箱4℃保存备用。样本纳入标准:(1)单根管的单根牙；(2)根管弯曲度≤15°(按Schneider 法测量)[2]；(3)自釉牙骨质界至根尖长度至少12mm；(4)根尖发育完全且未行牙髓治疗及根尖封闭。排除标准:(1)根管钙化；(2)牙根内外吸收；(3)显微镜下发现牙根隐裂纹或垂直根裂。本研究经首都医科大学附属北京口腔医院医学伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2.2 样本的处理与分组 用高速涡轮机于牙颈部釉质牙骨质界处截去牙冠，用10# 或15# 不锈钢K 锉(北京马尼，中国)疏通根管后，用M3-PRO 机用镍钛锉(上海益锐，中国)行根管预备至35#/ 0.06，预备过程中，大量2.5%次氯酸钠冲洗根管，超声荡洗后无菌纸尖干燥根管，热牙胶垂直加压充填直达根管口下2mm 左右，根管口用玻璃离子水门汀(glass ionomer cement，GIC)暂封。所有样本储存于37℃、100%湿度的恒温箱中。根管充填物完全硬固后，用金刚砂车针截去根尖段3mm，断面与牙体长轴垂直。显微镜下观察根尖截断面，排除微裂后按随机数字表法分为A(n=31)、B(n=31)、C (n＝31)三组。在水冷却状态下使用超声倒预备工作尖沿根管方向进行倒预备，预备出深3mm、直径1mm 的洞形，完成预备后用无菌生理盐水彻底冲洗，干燥，垂直加压器压紧根尖冠方的牙胶。显微镜下再次观察倒预备的窝洞侧壁，排除微裂。纸尖吸干后分别用iRoot BP Plus (A 组)、MTA(B 组)、GIC(C 组)行根尖倒充填，然后用一湿棉球清理根断面，去除多余充填材料。将所有样本置于37℃、100%湿度的恒温箱中保存7d，待材料充分固化。以上操作均由同一医师操作完成。

1.2.3 扫描电子显微镜(SEM)观察 三组随机取6 个样本用自凝树脂包埋，用慢速切割机在水冷却下于距根尖2mm 的倒预备区域内垂直于牙长轴横向切开，暴露材料和牙体的界面，超声荡洗去除切割过程中产生的碎屑后，干燥，分别在(1000 及(2000 的放大倍率下观察横切面倒充填材料与牙本质之间粘接界面的微观形态并进行拍照，用Image J 科学图像处理软件测量粘接界面微隙的最大宽度，精确到0.1μm。

1.2.4 薄片推出实验 每组随机取10 个样本用自凝树脂包埋，用慢速切割机在水冷却下将样本在3mm 的倒预备区域获取一个厚度约为1mm 的垂直于长轴的水平切片进行薄片推出实验。体视显微镜下观察断裂形式。将试件固定在万能测试机上，选直径略小于1.0mm 的特制加载头以1.0mm/ min的速度进行推出试验，测试时，加载头只能接触倒充填材料,而不触碰牙体组织,记录下倒充填材料突然脱位时的最大载荷(N)，计算粘接强度。

粘接面积(mm2)=倒充填材料直径×π×薄片厚度

粘接强度(MPa)=最大破坏载荷÷粘接面积

推出实验后，在体视显微镜(×25)下观察试件断裂界面。根据Huffman[3]对断裂模式的描述进行分类：a、粘接型：断裂面位于材料与根管壁牙本质界面之间；b、内聚型：断裂面位于倒充填材料内；c、混合型：以上两种断裂形式同时存在。

1.2.5 微渗漏检测 其余样本(每组15 个)用纸巾吸去水分。在样本表面上，从冠方至根尖断面上2mm 处均匀涂布两层指甲油(每次涂布间隔为1h)，使染料只能从根尖区域渗漏进入根管。指甲油干燥后，将样本浸入印度墨水，再置于37℃恒温箱。7d 后取出，流动水清洗去除样本表面的染料并刮除指甲油，干燥。用自凝树脂包埋样本，用慢速切割机在水冷却条件下沿牙体长轴纵向切开，置于OLYMPUS SZX 体视显微镜(×32)下观察，用Image J 科学图像处理软件(National Institutes of Health)测量渗入根管染料的最大长度(精确到0.1μm)。分别测量3 次后取平均值。

1.3 统计学方法 应用SPPS22.0 统计软件(IBM Corp.，美国)对数据进行统计学分析。采用独立样本t 检验进行两组间比较，采用单因素方差分析对多组间进行比较。

2.结果

2.1 粘接界面的微观形态观察结果 SEM 下观察各个实验组倒充填材料与牙本质之间的粘接界面，如图1。iRoot BP Plus、MTA 和GIC 三种材料与牙本质之间均有微间隙，间隙宽度不一，Image J 科学图像处理软件测量各粘接界面微隙的最大宽度显示GIC 与牙本质间的缝隙最明显，iRoot BP Plus 的边缘适应性较MTA 更优越。

2.2 粘接强度和断裂形式结果 如表1 所示，iRoot BP Plus、MTA 与根管内壁的粘接强度分别为(16.04±1.96)MPa、(13.55±2.01)MPa，两组间无显著性差异(P＞0.05)，均高于GIC 组(P＜0.05)。iRoot BP Plus、MTA 和GIC 三组试件均以混合型为主要断裂方式，GIC 组内粘接型断裂形式所占比例最高(30%)，MTA 组(20%)高于iRoot BP Plus组(10%)，图2 和图3 显示了典型的断裂形式及各个材料的断裂形式的比较结果。

图1 根尖倒充填材料与根管壁间横切面的形态学观察(扫描电镜图)

表1 三组倒充填材料粘接强度(MPa，)

表1 三组倒充填材料粘接强度(MPa，)

注：上标字母相同的组间差异无统计学意义(P＞0.05)，上标字母不同的组间差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.3 微渗漏检测结果 染色7d 后观察染色剂的渗透深度，如图4 所示，可见三个实验组都存在染色剂渗漏情况，iRoot BP Plus 和MTA 两组染料渗透深度明显小于GIC 组，有显著性差异(P＜0.05)，iRoot BP Plus 与MTA 两组之间无显著性差异(P＞0.05)，结果见表2。

图2 显微镜下观察到三种不同的断裂形式(×25)

图3 三种根管倒充填材料推出实验后的断裂形式比较(×25)

图4 体视显微镜下观察三组根尖倒充填材料的微渗漏情况

表2 三组根尖倒充填材料染料渗透深度()

表2 三组根尖倒充填材料染料渗透深度()

注：相同上标字母表示差异无统计学意义(P＞0.05)，不同上标字母表示差异有统计学意义(P＜0.05)。

3.讨论

根尖倒充填材料种类很多，从传统的银汞合金、玻璃离子水门汀、牙胶、复合树脂等，发展到近些年来的新型硅酸钙基生物相容性封闭材料(MTA、iRoot BP)，在物理、化学和生物学性能方面都有很大的进步。比如，MTA 能促进软组织的再生和成骨细胞的附着和增殖，并且有利于抑制细菌生长[4]。但是MTA 固化时间长，操作困难，价格昂贵，有潜在变色等缺点，并且在倒充填初期受根尖周组织液的浸泡、冲刷，易造成流失[5]。生物陶瓷类材料iRoot SP 和iRoot BP Plus 是一种预混型的亲水修复材料，具有强碱性，对牙髓组织毒性低，有抗菌性，并能促进生物矿化及牙髓和牙周组织的再生，可用于活髓保存、根管充填、穿孔修补和根尖倒充填[6]。有研究结果表明，iRoot BP Plus与MTA 理化性能相当，甚至较MTA 具有更好的生物相容性和封闭性[7,8]，也有学者报道，认为iRoot BP Plus 的封闭性能较MTA 差[9]。目前关于这两种材料的相关理化性能方面的综合性比较研究较少且结论不一。

根尖倒充填的目的是利用生物相容性材料在根尖区阻断微生物及其产物进入根尖周组织，达到良好的根尖封闭，建立有效的根尖屏障。因此，根尖倒充填材料的封闭性能对根尖手术的成功率尤为重要。衡量材料封闭性的常用指标是根管的微渗漏情况，其中，染料渗透法由于操作简单方便、易于掌握、且结果可信被广泛应用。本实验结果显示(表2和图4)，iRoot BP Plus 和MTA 的根尖封闭性能相当，没有统计学差异，但二者的封闭性能均优于GIC。Nair[10]和Leal[11]等人的研究也表明，作为根尖倒充填材料，iRoot BP Plus 与MTA 的根尖封闭性能无差异，与本实验结果一致。也有研究表明生物陶瓷类材料较MTA 的固化时间短、封闭性能好[11]。黄伟曼等[8]指出，在年轻恒牙直接盖髓的临床疗效观察中，iRoot BP Plus 在封闭性、生物组织相容性、诱导牙本质分化及促进生物矿化等性能上较MTA 有明显优势。也有学者得出不同的结论，Onay[9]、Hirschberg[12]等分别用液体传导方法、粪肠球菌冠方渗漏实验得出，iRoot BP 的封闭性能不如MTA。综合大多数研究可以发现，关于根尖倒充填封闭性能的实验结果存在差异，可能与采取的实验方法不同有关，这方面还需要进行更加深入全面的研究。iRoot BP Plus 不含引起牙变色的铝及氧化铋，血液的存在不会影响材料的固化，也不会导致牙冠变色。它在凝固反应过程中产生羟基磷灰石，与牙本质结合形成较强的粘连强度，从而达到良好的根尖封闭效果[13,14]。GIC 作为根管倒充填材料，具有对潮湿敏感、机械强度低、封闭性差、凝固后不具有长期的抗菌效果等特点[15]，这些局限性限制了它在根尖手术中的临床应用。

除了观察渗透性外，本实验还借助扫描电镜和Image J 科学图像处理软件精确观察并测量倒充填材料与牙本质间的微缝隙，从而对比不同材料与牙体组织之间的密合性。通过Image J 科学图像处理软件测量粘接界面微隙的宽度，如图1 所示，iRoot BP Plus、MTA 和GIC 三种材料与牙本质之间均存在微小间隙，GIC 的缝隙较iRoot BP Plus、MTA 更明显，iRoot BP Plus 较MTA 有更优越的边缘适应性。这个差异的产生不排除剖面选取的随机性、慢速切割及超声荡洗时一部分材料被冲刷流失以及倒预备时产生玷污层的可能。王密等[16]通过电镜实验评价iRoot BP 和MTA 作为髓底穿孔修补材料的研究结果与本研究结果一致。Shokouhinejad等[17]通过电镜观察根管的横剖面，发现iRoot BP Plus 和MTA 与根管壁间缝隙的发生率及大小无明显统计学差异，在纵剖面上，iRoot BP Plus 较MTA 边缘适应性更优越。MTA 在使用前需将粉液混合调拌，调拌的时间、粉液比例以及材料的调拌均质性均对封闭效果有影响，另外，MTA 固化前的糊状也增加了严密加压操作的难度。iRoot BP Plus 无需调拌，操作便捷，避免了调拌因素造成的材料机械性能的改变，同时，iRoot BP Plus 在固化过程中的体积膨胀也提高了边缘的适应性。而Onay 等[18]的研究发现，利用Er,Cr:YSGG 激光照射根管后，作为倒充填材料，iRoot BP 比MTA的微渗漏明显，且扫描电镜观察可见iRoot BP 与根管壁间存在缝隙，该结论的差异可能与采用了不同的根尖手术方法有关。随着新型根管治疗技术的创新与进步，根尖倒充填材料的选择与应用将面临新的挑战，需要更加深入的比较与研究。

本研究选择推出测试作为研究倒充填材料与根管内牙本质粘接强度的测试方法。如表1 所示，iRoot BP Plus 和MTA 相比粘接强度无显著性差异，且均以混合型为主要断裂方式(图2 和图3)。影响粘接强度的因素主要是倒充填材料本身固化后收缩应力的影响和根管内壁玷污层的清除。iRoot BP Plus 和MTA 固化后体积较稳定，固化后收缩应力的影响较小。有研究显示，根管充填前使用酸或乙二胺四乙酸溶液去除玷污层，可以增加根充物与洞壁的密合性从而减小渗漏[19]。本实验模拟临床显微根尖手术操作过程，采用的是无菌生理盐水反复冲洗倒预备界面，未使用EDTA 等化学试剂。倒预备后根管内壁表面可能会有玷污层存在，封闭部分牙本质小管，影响有效的或持久的粘接界面的形成,从而减弱倒充填材料与牙本质表面的化学性吸附。关于玷污层对粘接强度的影响的研究结果不一，有待于进一步探究。

目前关于根尖倒充填材料封闭性和粘接强度方面的研究大部分是短期的体外实验，深入研究其临床效果，有待于大样本的临床实验来进行客观评价。本研究结果认为iRoot BP Plus 和MTA 均具备良好的根尖封闭性能和粘接性，是目前理想的新型生物相容性根尖倒充填材料，未来将对其临床效果进行进一步的体内研究。