离子型稀土矿植物根际促生芽孢杆菌的筛选与鉴定

何森 ， 谢东 ， 宋美玲 ， 潘涛 ,2， 董伟 ,2

(1.江西理工大学资源与环境工程学院， 江西 赣州341000; 2. 江西省矿冶环境污染控制重点实验室， 江西 赣州341000)

0 引 言

稀土有着“工业维生素”“新材料之母”的称号，已广泛应用于众多高科技领域，对科技的发展做出了重大贡献[1-2]。 我国作为稀土大国，离子型稀土矿是我国特有的资源，早在20 世纪70 年代就已实施开采[3]，但由于早期开采工艺与设备的简单，造成了一系列的环境污染问题[4]，如植被破坏、水土流失、微生物种类减少等[5]。 在我国素有“稀土王国”美誉的江西赣州，因稀土开采导致18 个县（市、区）出现不同生态受损问题[1]。

国内外对于稀土废弃矿及尾矿的生态修复做了大量研究，主要修复方法有物理法、化学法、微生物法与植物法等。其中植物修复技术具有修复成本低，操作简单，不产生二次污染等优点，在矿山修复中有着良好的应用前景[6]。 Khan、徐芮等发现一些植物能够蓄积稀土元素[7-8]，刘胜洪等则进一步利用香根草紫花苜蓿、柱花草、马唐草、虮子草、山毛豆、木豆、翅荚决明、油桐等多种植物对稀土矿区进行植物修复[9]，发现这些植物具有较高的耐胁迫能力，并且通过不同配置取得了很好的修复效果。然而随着研究的深入，科研人员发现植物修复的大多数超累积植物具有生物量低、 植物难以回收等缺点，导致该技术无法大规模应用[10]。 因而研究人员将关注点聚焦于微生物与植物存在着的互利共生关系，以期提高植物的抗逆性， 利用植物-微生物联合修复技术来解决植物修复土壤生态问题[11-12]。

细菌不仅在维持土壤肥力与结构方面发挥着重要的作用，同时也会敏感地对细微的环境变化做出相应的反应，如土壤中积累的重金属对细菌的生理生态产生影响，因此细菌被认为是重要的土壤质量研究的有效生物指标[13]。 植物根际促生菌（Plant Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR）是指分布在植物根际周围的一类能够分泌有益物质从而促进植物生长的细菌[14-16]，在植物-微生物联合修复中发挥着重要作用。目前已发现的植物根际促生菌主要包括芽孢杆菌属 （Bacillus spp.）、 假单胞菌属（Pseudomonas spp.）、沙雷氏菌属（Serratia spp.）、固氮 螺 菌 属 （Azospirillum spp.）、 不 动 杆 菌 属（Acinetobacter spp.）、 无 色 菌 属 （Achromobacter spp.）等[17-20]。 其中芽孢杆菌属（Bacillus spp.）是一类非致病的对机体无害的好氧细菌， 具有耐酸碱、耐高温、耐挤压、极高的环境兼容性和对重金属有较好吸附性等特点[18-19]，在土壤修复上具有极高的应用前景。

然而，针对离子型稀土矿山植物根际促生菌的研究较少。 前期报道主要集中对含镉、铅等重金属污染土壤根际促生菌的筛选、鉴定及促生能力的研究[21-23]，例如Chen 等从重金属污染土壤中筛选出了两株植物促生菌J62 与Y-1-3-9[20]，它们都具有促进植物生长作用和对Cd 的吸收作用。 因此，本研究以赣南离子型稀土废弃矿区植物修复过的根际土壤为试验对象，从根际土壤中筛选具有根际促生能力的芽孢杆菌菌株，探索菌株的促生特性及其对稀土离子的耐受力。试验获得的数据有利于人们加深对赣南离子型稀土废弃矿的植物修复作用的了解， 也进一步为实施植物-微生物联合修复的可行性提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 土壤样品

土壤样品取至我国江西省赣州市龙南稀土矿区（东经 114.84°，北纬 24.83°）。 用铁铲将杉树、湿地松、桉树等植株根部周围土壤去除，用毛刷将根上附着的土壤收集，置于冰盒中低温保存带回实验室置于零下80 ℃备用。

1.1.2 主要试剂与培养基

主要试剂：L-色氨酸（国药集团化学试剂有限公司）；铬天青S（上海麦克林生化科技有限公司）；Nessler’s 试剂（上海麦克林生化科技有限公司）；硝酸铥（上海九鼎化学科技有限公司）；硝酸铽（上海九鼎化学科技有限公司）。

菌株的初筛、 发酵培养和保存均利用Luria-Bertani（LB）培养基；采用 Salkowski 试剂测定菌株产吲哚乙酸（IAA）能力[24]；利用无铁（KMB）培养基检测菌株产铁载体能力[25]；利用 Nessler’s 试剂测定 NH3的产生能力[24]。

1.2 试验方法

1.2.1 根际芽孢杆菌的初筛

使用分析天平准确称取根际土壤10 g，加入带有玻璃珠和90 mL 无菌水的250 mL 三角瓶中， 将其放入摇床150 rpm 振荡10 min，后静置10 min。 取其上清液1 mL 于EP 管内，置于80 ℃水浴10 min，后放入冰块中迅速冷却至室温，吸取100 μL 上清液涂布到LB 固体培养基上，放入恒温培养箱（37 ℃）中过夜培养。 挑取单菌落于LB 固体培养基上进行划线纯化培养3 次，并分别编号，用浓度为30%的无菌甘油于-28 ℃保存备用。

1.2.2 菌株促生性质的研究

1）产吲哚乙酸（IAA）能力的测定：将待测菌株接种到含有0.5 g/L 色氨酸的LB 液体培养基中摇床培养（37 ℃，150 r/min）36 h，后取 50 μL 培养悬浮液到白瓷板中， 加入100 μL 显色试剂 （4.5 g/L FeCl3，10.8 mol/L H2SO4），室温下避光放置 30 min，观察颜色变化，颜色变红则表示有IAA 产生。 将培养液在8000 rpm 下离心5 min，取2 mL 上清液，加入4 mL 显色试剂，着色30 min 后，用分光光度法测定550 nm 处的光密度，可对IAA 的产生能力进行定量测定。

2）产铁载体能力的测定：将待测菌株接种到带无铁（KMB）培养基中摇床培养 24 h（37 ℃，150 r/min），然后 8000 rpm 离心 5 min 取上清液，按 1∶1 的比例将该上清液与CAS 检测液混合， 若颜色由蓝色变成橘红色则有铁载体的产生。 以富铁培养基为对照，用分光光度法测定630 nm 处的光密度，可测定产铁载体的数量。

3）产NH3能力的测定：将菌株转接到含10 mL蛋白胨水培养基的(10g/L)试管中，摇床培养72 h（37 ℃，150 r/min）， 每管加入 0.5 mL 的 Nessler’s试剂，颜色由褐色转为黄色的表明有NH3产生。

1.2.3 菌株的鉴定

将筛选到的菌株中促生能力较强的菌株用LB液体培养基培养至对数生长期， 离心收集菌体，并提取细菌的基因组DNA， 采用通用引物 (正向引物：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’； 反向引物：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’） 扩增其细菌基因组DNA 中16S rRNA 基因片段。 扩增产物经测序后，将所测序列输入到NCBI 上进行数据库对比， 利用MEGA5.1 构建系统发育树以确定菌株的种类。

1.2.4 芽孢杆菌对稀土离子铥、铽的耐受性分析

将培养至对数生长期的具有较强促生能力的芽孢杆菌菌液，取50 μL 接种到含有不同浓度（等浓度梯度）硝酸铥与硝酸铽的LB 培养基中。 以未接种的LB 液体培养基为对照， 在600 nm 波长下测定0～12 h 菌株的生长曲线，利用SPSS 22.0 计算出半抑制浓度（IC50）。

以上各项定性和定量检测均进行两次独立试验，每次独立试验均设置了3 个重复。 以上试验数据采用Microsoft Excel 2016 软件进行处理， 采用SPSS 22.0 进行IC50的统计分析。

2 研究结果

2.1 根际芽孢杆菌的初筛结果

离子型稀土矿区植物根际土壤经过80 ℃水浴处理后，水样经稀释涂布法在LB 培养基上进行分离纯化，根据菌株不同的形态特征，从赣州市龙南稀土矿区根际土壤初步分离筛选到了31 株芽孢杆菌菌株。

2.2 初筛菌株的促生特性

微生物菌株分泌吲哚乙酸（IAA），能够促进植物根系的生长和根际分泌物的产生， 从而提高植物对土壤中营养物质的吸收[26-27]。 本试验利用Salkowski 法对上述31 株芽孢杆菌产IAA 的能力进行了测定，结果如图1 所示，筛选出的14 株芽孢杆菌具有产IAA 能力，IAA 产量的范围为3.65～36.63 mg/L， 其中菌株 P3-3、Y16-2、Y18-3 所产 IAA的活性较高，分别达到 36.63，30.08，34.74 mg/L。

图1 具有产IAA 能力的芽孢杆菌产IAA 量

铁载体的产生不仅能与土壤中的Fe、Cu、Zn、Cd 等重金属离子结合，使重金属离子活化，并且能够抑制有害微生物的生长[3]。 固氮细菌能将空气的N2转化为 NH3，也具有促进植物生长的作用[26]。 因此， 本试验对具有产IAA 能力的芽孢杆菌进行了产铁载体与产NH3的定性测定。 结果见表1，具有产铁载体能力的菌株有5 株，具有产NH3能力的菌株有14 株， 而同时具有产铁载体和氨气的有5 株，分别为 P3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3， 而菌株Y17-1 不具有产铁载体能力， 也不具有产NH3能力。理论上，所筛菌株能在实际植物修复中产生一定的作用， 应具有多项促生特性， 其中菌株Y18-3不仅具有较高的产IAA 活性， 又可固氮和产生铁载体，具有较强的促生特性，因此可作为目标菌种进行下一步试验。

2.3 菌株的基因序列鉴定结果

将所筛选的5 株具有多项促生特性的菌株P3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3 基于 16S rRNA基因测序分析，将所得扩增序列与NBCI 数据库进行同源性比较，初步鉴定该5 种菌株菌属。 结果如图2 所示，该5 种菌株均属于芽孢杆菌：菌株P3-1与Y17-2 属于蜡样芽孢杆菌，SP1-3 属于假蕈状芽孢杆菌，菌株Y18-2 属于解木糖赖氨酸芽孢杆菌，Y18-3 属于纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。

表1 产IAA 芽孢杆菌其他促生特性

图2 筛选的5 株菌株16S rRNA 基因序列系统发育树

2.4 菌株Y18-3 对稀土离子铥、铽的耐受性

菌株Y18-3 在不同浓度下稀土离子的生长曲线如图3 和图4 所示， 高浓度稀土离子铥、铽对菌株的生长有一定的抑制作用， 而且随着铥、铽离子浓度的增加，菌株进入对数生长期的时间越晚。 从图3 可看出，稀土离子超过一定浓度后菌株不再生长， 当铥离子浓度达到3.24 mmol/L时，菌株将无法继续生长。 稀土离子铥、铽对菌株Y18-3 造成半致死效应后的浓度均超过 2 mmol/L，分别达到 2.22，2.29 mmol/L，说明菌株Y18-3 对于三价稀土离子铥、铽都具有极高的耐受性。

图3 菌株Y18-3 对铥离子的耐受性

图4 菌株Y18-3 对铽离子的耐受性

3 讨论与结论

植物根际促生菌 （PGPR） 的概念最早是Kloepper 等提出的[26]，近年来受到了广泛的关注，PGPR 不仅能促进植物的生长， 还会影响对土壤重金属的吸收，改善土壤的生态环境[27-29]。 PGPR是通过分泌生长素、产铁载体、产 NH3、溶磷、解钾等机制直接或间接的促进植物的生长[30-31]，目前PGPR 的筛选大多以此为依据， 如王小兵等从江苏沿海滩涂分离得到了具有显著促生作用的细菌[32]，测定了产ACC 脱氨酶、产IAA、产铁载体的能力。冀玉良以溶磷、解钾为筛选指标[31]，从商州区油菜根际土壤中分离得到了19 株PGPR， 后续测定了产NH3、产IAA 和固氮能力，其中K-25 的促生能力最强。 李想等测定了5 项促生指标， 包括产NH3、产HCN、产铁载体、溶磷能力、解钾能力[33]，对初筛得到的20 株菌株进行再次培养筛选，结果表明B2-4、B3-1、LX4、LX5、B3-6、LX7、LY-1 为 植 物 根 际促生菌。

本研究从赣南离子型稀土矿筛选得到了31 株菌株，通过对产IAA、产铁载体与产NH3能力的检测鉴定后，成功分离并得到了具有显著促生作用的菌株Y18-3。 经16S rRNA 基因序列分析结果表明，菌株Y18-3 属于纺锤形赖氨酸芽孢杆菌。 前期研究表明，芽孢杆菌作为土壤中的优势菌种，能通过产芽孢的方式在各种恶劣环境下存活[21]，本研究从离子型稀土矿区植物根际筛选得到的具有较强促生能力的菌株大多为芽孢杆菌，这一发现也与之前的研究结果类似。 例如，谢越盛等从植物根际筛选了838 株菌株[34]，通过对其促生能力进行赋值评价，指纹图谱分析以及温室实验， 探究出具有较好促生能力的菌株为JC01，经16S rRNA 基因鉴定为枯草芽孢杆菌；张义等利用保绿法和萝卜子叶增重法从芡实根际土壤中分离出2 株有较好效果的菌株Q6-2、Q67[35]，经鉴定均为地衣芽孢杆菌。

细菌通过排除、调节、生物转化、甲基化与去甲基化等方式，从而表现出对重金属的耐受性[36]，并且通过产生一定的酸性物质（如乙酸）来提高重金属的溶解度，提高重金属离子的可利用性，通过去除、螯合和固定作用除去金属的毒素[37]。 一般来说，为了评估所分离得野生菌株在实际生物修复中的有用性，则需要检测其重金属的耐受性。 如黄军等从高浓度重金属污染土壤中分离纯化出1 株具有较强镉耐受性的菌株LY29-1-5[38]，该菌株表现耐受镉离子的最高浓度为15 mmol/L，同时也对低抑制浓度的铅、铜、锌表现出了一定的耐受性。向君亮等从狗尾草根际土壤中共分离得到两株具有固定重金属和促生能力的菌株N3 和H12[39]，并通过摇瓶吸附试验和小麦种植培养试验验证了这两株菌株对小麦生长的促进作用， 以及对吸收Cd 和Pb的阻碍作用。 本研究中同样检测了菌株Y18-3 对铥的耐受性半致死浓度为2.22 mmol/L， 对铽的耐受性半致死浓度为2.29 mmol/L， 菌株对铥和铽离子的耐受性都极高， 因此可见Y18-3 是对稀土离子具有抗性的芽孢杆菌菌株。

该研究主要得到以下结论： ①从江西省赣州市龙南离子型稀土矿区土壤中筛选得到31 株芽孢杆菌， 其中能分泌 IAA 的有 14 株， IAA 产量最高的菌株是 P3-3、Y16-2、Y18-3，分别达到 36.63，30.08，34.74 mg/L； 同时具有产铁载体和 NH3能力的菌株有 5 株，分别为 P3-1、SP1-3、Y17-2、Y18-2、Y18-3；②菌株 Y18-3 具有高产 IAA、产铁载体和NH3等较强的促生特性，同时对铥与铽等稀土离子有较高的耐受性，半致死浓度均大于2 mmol/L，经16S rRNA 基因序列分析鉴定为纺锤形赖氨酸芽孢杆菌； ③该依据所筛选并鉴定出的根际促生芽孢杆菌菌株具有潜在的促生及土壤修复作用，但尚未验证其实际对植物的促生作用与土壤的修复效果， 可通过进一步的盆栽实验或大田实验进行确认。

综上所述，本研究结果为促进赣南稀土矿区植物根际促生菌的开发利用提供了基础数据，为进一步利用根际促生菌改善土壤生态环境，助力赣南离子型稀土废弃矿植物-微生物联合修复的实施提供科学依据与可行方法。