维甲酸对异位子宫内膜组织自噬和血管生成的影响

马宇倩　马孝红　路会侠

【摘要】 目的：觀察小鼠异位子宫内膜组织中自噬标记物Beclin 1及血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达变化情况，探讨维甲酸（Retinoic Acid，RA）对异位子宫内膜病灶中自噬及血管生成的作用。方法：100只BALB/c雌性小鼠分为5组：CTRL组，EMs组，LOW组[100 mg/（kg·d）]，HIGH组[200 mg/（kg·d）]，CQ组;药物灌胃7 d后处死取材，行Real-time PCR，Western blotting定量分析及MVD测定。结果：EMs组、LOW组Beclin 1、VEGF mRNA表达均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF mRNA表达均低于LOW组，差异均有统计学意义（P<0.05）。EMs组、LOW组Beclin 1、VEGF蛋白表达均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF蛋白表达均低于LOW组，差异均有统计学意义（P<0.05）。EMs组、LOW组MVD计数均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组MVD计数低于LOW组和EMs组，差异均有统计学意义（P<0.05）。结论：高剂量维甲酸可抑制EMs异位病灶中的自噬及血管生成。

【关键词】 子宫内膜异位症 维甲酸 自噬 血管生成

Effects of Retinoic Acid on Autophagy and Angiogenesis in Ectopic Endometrial Tissue/MA Yuqian， MA Xiaohong， LU Huixia. //Medical Innovation of China， 2021， 18（36）： 0-026

[Abstract] Objective： To observe the expression of autophagy marker Beclin 1 and vascular endothelial growth factor （VEGF） in mouse ectopic endometrium， and to explore the effect of Retinoic Acid （RA） on autophagy and angiogenesis in ectopic endometrium. Method： 100 BALB/c female mice were divided into 5 groups， CTRL group， EMs group， LOW group [100 mg/（kg·d）]， HIGH group [200 mg/（kg·d）]， CQ group; after 7 days of drug gavage， they were killed and taken for real-time PCR， Western blotting quantitative analysis and MVD determination. Result： The mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the mRNA expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The protein expressions of Beclin 1 and VEGF in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the protein expressions of Beclin 1 and VEGF in HIGH group were lower than those in LOW group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MVD counts in EMs group and LOW group were higher than those in CTRL group， the differences were statistically significant （P<0.05）; the MVD count in HIGH group was lower than that in LOW group and EMs group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： High dose Retinoic Acid can inhibit autophagy and angiogenesis in ectopic lesions of EMs.

[Key words] Endometriosis Retinoic Acid Autophagy Angiogenesis

First-author’s address： Clinical Medicine Collage of Dali University， Yunnan Province， Dali 671000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.36.006

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是有生长活性的子宫内膜组织、腺体和间质，异位到子宫腔以外的部位并生长，发病机制与自噬（autophagy）密切相关[1]。组织病理学发现异位内膜组织最典型的特征之一就是密集的血管化及高表达的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）[2]，临床使用抗血管治疗可以降低EMs的复发率[3]。维甲酸（Retinoic Acid，RA）主要用于治疗某些细胞增殖性疾病和高VEGF表达的疾病。RA可通过抑制细胞自噬从而抑制高糖诱导的视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和管腔形成[4]。

笔者前期研究發现RA在体外可诱导异位内膜基质细胞中自噬标记物Beclin 1表达增加[5]，但体内异位内膜组织中RA如何影响自噬，是否对EMs的血管生成（angiogenesis）有作用尚不清楚。本研究拟使用小鼠动物模型观测RA对异位内膜组织中Beclin1和VEGF表达的变化，进一步探讨RA对EMs异位内膜组织中自噬与血管生成的影响。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验试剂 Beclin 1多克隆抗体（美国Cell Signal公司），VEGF多克隆抗体（美国Cell Signal公司），氯喹（Chloroquine，CQ），RA（美国 selleckchem公司），山羊抗兔二抗（杭州联科生物技术股份有限公司）。

1.2 实验动物分组与给药 于2019年5-9月饲养SPF级BALB/c雌性成年小鼠共100只，体重（25.00±3.49）g，由昆明医科大学动物实验中心提供，动物合格证号：SCXK（滇）2014-0011，共分为5组，每组20只。对照组（CTRL组）正常饲养，未做任何处理;其余采用自体移植法建立人工EMs小鼠模型，造模成功后，随机分为：单纯手术组（EMs组），RA低剂量组[LOW组，100 mg/（kg·d）]，RA高剂量组[HIGH组，200 mg/（kg·d）]，氯喹组[CQ组，40 mg/（kg·d）]，各组分别用相应药物灌胃，连续治疗7 d。本动物实验经医院伦理委员会批准，符合动物伦理要求。7 d后，小鼠断头采血备用，同时摘取卵巢、剥离在位子宫内膜和异位子宫内膜，常规固定于4%多聚甲醛中，用于组织切片分析;取部分异位内膜组织，去除周围的腹壁组织，液氮冷冻保存待用。

1.3 观察指标

1.3.1 实时定量PCR检测Beclin 1、VEGF mRNA表达 组织总RNA提取按Trizol试剂说明书进行，进行小鼠内膜组织总RNA抽提纯化和互补脱氧核糖核酸合成。每份样本设计3个复孔。混匀后，放入PCR仪，反应程序：95 ℃预变性10 s，95 ℃ 15 s、

60 ℃ 20 s、72 ℃ 20 s，共30个循环。样本RT-qPCR，95 ℃ 1 min，95 ℃ 3 s，56 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共35循环。引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。见表1。

1.3.2 蛋白印迹法（Western blotting）分析Beclin 1、VEGF蛋白表达 称标本质量，匀浆冻干，蛋白小丸用蒸馏水溶解，样本加到10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上，电泳分离出待检测蛋白后电转移，脱脂牛奶室温下封闭2 h，用洗脱缓冲液漂洗3次，10 min/次，加入抗体（1︰1 000），4 ℃过夜，再次漂洗，加入二抗

（1︰2 000），室温孵育1 h，化学发光法显色并照相，用ImageJ分析各条带吸光度值D。

1.3.3 微血管密度（microvessel density，MVD）测定 MVD（×200倍镜下选择5个最高MVD区域进行计数，取平均值）。所有剥离出来的异位内膜组织标本HE染色后，以抗CD34单克隆抗体标记血管中层及斑块的内皮细胞，然后在高倍镜下计数每一视野的微血管数，以被染成棕褐色的单个内皮细胞或内皮细胞簇作为1个血管计数，只要结构不相连，其分支结构也计作一条血管。计数方法：在至少3个异位内膜血管着色最密集的区域和高倍镜（×200，每个视野面积1.0 mm2）下计数微血管数，并取其平均值作为该片的MVD值。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验;计数资料以率（%）表示，比较采用字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时定量PCR检测各组GAPDH、VEGF、Beclin 1 mRNA表达水平比较 EMs组、LOW组Beclin 1、VEGF mRNA表达均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF mRNA表达均低于LOW组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF mRNA表达与CTRL比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。HIGH组Beclin 1、VEGF mRNA表达与CQ组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图1和表2。

2.2 蛋白印迹法分析各组GAPDH、VEGF、Beclin 1

mRNA表达水平 EMs组、LOW组Beclin 1、VEGF蛋白表达均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF蛋白表达均低于LOW组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组Beclin 1、VEGF蛋白表达与CQ组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图2、3和表3。

2.3 各组小鼠MVD计数比较 依据Weidne法行MVD计数，CD34染色的微血管结构（图4）。CTRL组MVD计数为（21.69±6.73），EMs组MVD计数为（68.07±5.54），LOW组MVD计数为（51.98±2.46），HIGH组MVD计数为（38.32±5.03），CQ组MVD计数为（30.91±3.23）。EMs组、LOW组MVD计数均高于CTRL组，差异均有统计学意义（P<0.05）;HIGH组MVD计数低于LOW组和EMs组，差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

真核细胞通过利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质完成自噬，应对环境改变。当EMs异位病灶处于氧化应激、炎症等刺激下或患者雌、孕水平变化均可影响异位内膜细胞的自噬活性[6-8]。

EMs具有侵襲、种植、转移等与恶性肿瘤相似的特点，某些抑癌基因可能通过调节自噬参与EMs的发生发展[9]。Beclin 1既是抑癌基因，又是自噬的正向调控因子，在EMs病程中必不可少[10]。自噬能够促进肿瘤血管生成，机制是通过保护性自噬维持细胞内代谢平衡和细胞稳态，从而调控血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）的形成[11]。自噬特异性基因Beclin 1参与了胃癌中VM的形成[12-13]。本实验发现Beclin 1及VEGF在EMs异位病灶中高表达，MVD数量亦最大，提示自噬对血管生成有促进作用。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）联合抗-VEGF在抑制视网膜新生血管中可能比单纯抗-VEGF发挥更好的作用[14]。笔者应用自噬抑制剂CQ同样下调了异位病灶中VEGF的表达，与上述研究结果一致。

EMs的经典治疗为手术治疗及术后长期药物治疗[15]。除对症治疗及激素疗法外，新的治疗如抗血管生成等“源头治疗”在临床已有应用，包括血管生长因子抑制剂，抗血管生成抑制剂等[16]。RA是天然维生素A的代谢产物，常用于治疗某些细胞增殖性疾病（如白血病）和高VEGF表达的恶性肿瘤。RA及其下游途径通过控制促血管生成或抗血管生成信号调控血管生成。在脉络膜、大脑皮质及肺，RA以血管内皮生长因子A（VEGFA）为靶点调控血管生成[17]。崔仁哲等[18]报道RA可抑制角膜新生血管中VEGF的表达而抑制新血管的形成。全反式维甲酸（ATRA）可降低食管癌细胞VEGF等的表达影响新生血管的生成[19]。RA针对EMs中血管的作用报道较少。笔者前期细胞实验发现RA可诱导异位内膜基质细胞中自噬的发生，且与浓度呈正相关[20]。在本次动物实验中，高浓度RA抑制Beclin1并下调VEGF表达，作用效果与自噬抑制剂CQ几乎相等，表现出对血管生成的调控作用。

RA调节血管生成的机制尚不十分清楚，已有报道PI3K/Akt/mTOR是重要的调节VEGF 表达的信号通路[21]，周凡[22]发现atRA（全反式维甲酸）可显著激活3T3-L1 前脂肪细胞中PI3K/AKT/mTOR 通路; 孙林[23]实验证明扶肾方可能通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路发挥抑制腹膜血管新生作用。RA对子宫内膜异位症中自噬及血管生成调节作用的机制及内在的相关性，有待进一步

研究。

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（收稿日期：2021-04-26） （本文编辑：姬思雨）