水产品中内分泌干扰物残留检测方法研究进展

黄合田，杨鸿波，孙晓红，郭 峰

(1.贵州医科大学 公共卫生学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省分析测试研究院，贵州 贵阳 550014；3.国家地质实验测试中心，自然资源部生态地球化学重点实验室，北京 100037)

环境内分泌干扰物(EDCs),是一类存在于环境介质中并介导生物体内分泌激素的合成、释放、代谢、结合和排泄作用，对其后代产生有害影响的外源性化学物质；因干扰内分泌系统的过程与雌激素类似，故也被称为环境激素[1-2]。环境内分泌干扰物分为自然存在和人为合成，人为合成的主要来源于人类广泛的农业和工业活动，如常见的有机氯农药、己烯雌酚、双酚A、多环芳烃类和多氯联苯类(PCBs)等，研究表明，其中已有300多种物质危害人类和动物的健康[3-5]。近年来随着环境内分泌干扰物的广泛应用以及未经处理的各类废水排放，使得各地环境受到不同程度的污染。Luo等[6]检测分析了湘江的21种环境内分泌干扰物的质量浓度水平，发现烷基酚的质量浓度最高，为0.8～3100 ng/L；Kumirska等[7]利用气相色谱质谱法分析污水处理厂的污泥和鱼塘沉积物，检出17-β-雌二醇、17-α-炔雌醇等13种环境内分泌干扰物，质量浓度为未检出～489 μg/kg。

随着养殖业和近海渔业的快速发展，集中饲养已成为主要的饲养方式。为提高产量在饲料中添加蛋白同化类激素药物增加水产品蛋白转化率，或是直接在养殖水中施用过量的药物用于治疗和预防疾病。环境内分泌干扰物化学性质比较稳定、不易降解、半衰期长，极易在环境中积累并破坏生态系统的稳定性[8-9]。研究表明，环境中类固醇类激素质量浓度1 ng/L时即可影响水生生物的内分泌系统、神经系统和免疫系统的正常功能[10-11]。如不利于雌鱼卵母细胞生长和成熟；雄鱼的睾丸变小且精子数量减少；促性腺激素释放激素、神经元的破坏和免疫系统功能异常[12-14]。有研究表明，一定剂量的环境内分泌干扰物会影响人体健康，如发生骨细胞的分化和凋亡，诱发女性过早绝经并影响生殖发育，增加患乳腺癌等疾病的风险，导致DNA编码、蛋白质合成和体内内源性激素代谢异常从而进一步影响各个系统的正常功能等[11,15-16]。世界卫生组织和联合国环境规划署出版的《关于EDC的第二份科学声明》表示，肥胖等慢性非传染性疾病、生殖系统疾病和激素敏感性癌症等的发生与环境内分泌干扰物暴露密切相关[1]。目前，国内外均有相关的法律和法规限制或禁止将己烯雌酚等环境内分泌干扰物应用于水产养殖。我国农业部235号公告修改版《动物性食品中兽药最大残留限量标准》规定了丙酸睾酮等药物可作为治疗药物，但不得在动物性食品中检出，醋酸甲孕酮、己烯雌酚、甲基睾丸酮等禁止使用，同时在食品中也不得检出。

为保障我国水产品食品安全和产业的可持续健康发展，必须加强水产品中环境内分泌干扰物的检测和监督管理。由于环境内分泌干扰物种类繁多、化学性质差异大、含量低，并且水产品含有大量的脂肪基质等干扰物质，需要相适应的前处理技术进行分离净化以及高通量、高灵敏度的检测分析技术。笔者综合近年来已发表的文献，阐述水产品中环境内分泌干扰物的提取、净化和仪器检测方法，包括传统和新型提取技术的比较和应用，固相萃取等常用的净化技术，以及高灵敏度的质谱方法和快速分析的免疫分析法，为今后快速、简便、高效地检测水产品中的多种环境内分泌干扰物残留提供科学理论依据。

1 水产品中环境内分泌干扰物残留检测技术

1.1 样品前处理技术

样品的提取是影响检测分析方法结果准确度的重要因素，如果样品净化不完全易导致严重的基质效应和仪器污染。水产品中含有丰富的脂肪酸和油脂，极易影响水产品中残留环境内分泌干扰物的提取和净化。

1.1.1 样品提取技术

水产品中环境内分泌干扰物残留的提取效率是前处理的关键，直接影响方法的灵敏度。现已报道的传统提取方法如索氏提取、液液萃取、超声波萃取等方法，以甲醇、乙腈和正己烷等溶剂为提取液。但这些处理方法存在操作繁琐、有机溶剂消耗大、重复性差以及回收率低等缺点。随着新技术的发展，如双水相萃取、亚临界萃取、固相微萃取、QuEChERs等方法有效克服传统提取方法的缺点，具有操作简单、省时、溶剂消耗量少、回收率高且重复性好等优点，在食品和环境等领域广泛应用。Wang等[17]使用索氏提取、加速溶剂提取和微波辅助萃取提取鱼样中多氯联苯和多溴联苯醚，萃取的时间由24 h缩至40 min；对于辛醇—水分配系数大的多氯联苯同源物，索氏提取的回收率低于加速溶剂提取和微波辅助提取法。水产品中环境内分泌干扰物残留的提取方法的应用及主要特点见表1。

表1 水产品中环境内分泌干扰物残留分析提取技术的应用及特点Tab.1 Application and characteristics of extraction and analysis methods of endocrine disrupting chemicals(EDSs) in fishery products

由表1可知，各种前处理提取方法均有各自的优缺点，可将多种提取方法结合使用，提高提取效率。对实际样品的检测分析，需要根据水产品的种类、环境内分泌干扰物的特性以及所使用仪器的灵敏度等选择相应的提取方法，保证获得检测结果的准确。

1.1.2 样品净化方法

目前常用的净化方法为柱层析法、固相萃取(SPE)法和凝胶渗透色谱法。凝胶渗透色谱法是以多孔性凝胶为固定相，根据相对分子量的大小对样品中各组分进行分离的方法。分子量小的物质进入凝胶孔中停留时间长，分子量越大停留时间越短。凝胶渗透色谱法去除脂肪、蛋白质和色素等大分子物质效率高，通过优化杂质洗脱时间和主收集时间可得到较好的净化效果，有利于目标分析物的富集得到较好的回收率[24]。柱层析法和固相萃取原理类似，均是通过吸附和洗脱的方法对样品进行分离和纯化[25]。柱层析法根据物质在固定相上的吸附能力，收集不同填料层的洗脱液。相对于此，固相萃取法通过少量的洗脱液完成水产品中单个或多种残留环境内分泌干扰物的净化和富集，有利于环境的绿色建设，并且现在使用的固相萃取柱多为商业化产品，种类繁多并且材料填充紧实，净化材料也不易吸附待测组分，尤其对于短时批量净化和富集水产品中残留环境内分泌干扰物十分方便，是目前最常用的净化手段。3种净化方法的部分应用实例见表2。

表2 水产品中环境内分泌干扰物残留分析净化技术的应用Tab.2 Application of purification technology in residue analysis of EDCs in fishely products

2 检测技术

2.1 色谱法

色谱法是根据物质在不同固定相中的选择性分配，不同的物质在流动相洗脱下以不同的速度移动，最终实现分离的效果。如高效液相色谱技术以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，因其分离效率高、分析速度快被广泛应用。适用于分析不易挥发、热不稳定性的物质。同时高效液相色谱可结合紫外检测器、荧光检测器等不同的检测器使用。江洁等[18]采用液液萃取结合高效液相色谱技术检测分析罗非鱼肌肉组织中的6种激素，其中雌二醇、睾酮、甲基睾酮、醋酸甲轻孕酮的回收率较好(>70%)，检出限为0.05～0.10 ng/L。Ismail等[19]采用高相液相色谱结合荧光检测技术检测鱼类中的双酚A，检出限为0.005 μg/kg，在250 μg/kg、500 μg/kg加标水平下回收率为61.54%～93%。但是此技术消耗有机溶剂量大，要求复杂基质的样品前处理净化程度高；相对于质谱等高灵敏度的分析器，含量较低的样品易导致假阴性结果的出现。

2.2 质谱法

质谱法是现在分析手段中最常用的检测技术，通过气相或液相与质谱联用，并结合高效净化的前处理技术能在短时间内同时分析检测复杂基质中的多种环境内分泌干扰物。质谱作为检测系统，利用四级杆质谱、飞行时间质谱、四级杆—静电场轨道阱质谱等质量分析器，获得分子离子峰的准确质量数和碎片离子等信息，准确定性定量分析不同基质中的环境内分泌干扰物。因其高通量、高灵敏度和高精密度成为分析检测各种介质中痕量环境内分泌干扰物的常用手段。

气相色谱质谱法、气相色谱串联质谱法是现在常用于分析易挥发、热稳定类环境内分泌干扰物的主要分析手段。通过气相色谱分离组分复杂的痕量有机物，并结合质谱的高灵敏度对化合物实现分离和准确定量分析。Liu等[31]利用气相色谱质谱法和选择离子监测模式分析检测云南昆明水产品市场鱼中的8种类固醇激素和酚类物质，各物质回收率为55.1%～100.6%，相对标准偏差为2.3%～12.7%，方法检出限为0.3～0.7 μg/kg。但对于低挥发性、含量极低的部分类固醇类激素则需要衍生化来满足仪器检测灵敏度。而衍生化会使得前处理操作繁琐和耗时，并且衍生化的反应时间、温度、衍生化试剂的极性大小和用量对衍生化效率都有较为明显的影响，同时还会产生副产物[32-34]；并且同时衍生化多种类别激素比较困难。近年来文献采用气相色谱质谱联用仪为检测手段的研究见表3。

表3 水产品中环境内分泌干扰物残留的气相色谱质谱联用法、气相色谱串联质谱联用法检测实例Tab.3 Examples of EDCs residue detection in fishery products by GC-MS or GC-MS/MS

液相色谱串联质谱联用法与气相色谱质谱法、气相色谱串联质谱法类似，是以液相色谱作为分离系统，质谱作为检测系统。相对于气相色谱质谱法、气相色谱串联质谱法，液相色谱串联质谱联用法的前处理操作相对简单，不需要对目标分析物进行衍生化，可以分析某些难挥发、热不稳定性的化合物。Ye等[42]建立了超高效色谱质谱联用法快速筛查和定量分析鱼肉中甾体激素和酚类物质，平均回收率为71.2%～108%，相对标准偏差小于16%，检出限0.04～0.08 ng/g。近年来飞行时间质谱、四级杆—静电场轨道阱质谱等在食品安全领域逐渐深入使用，利用高分辨质谱的高分辨率、高灵敏度和强抗干扰能力，以及结合相应的数据库可高通量快速筛查水产品中环境内分泌干扰物残留，同时还可通过数据回顾性分析发现其他潜在的有机污染物。如鞠玲燕等[43]采用超高效液相色谱结合四极杆—静电场轨道阱高分辨质谱快速筛查和分析水产品中28种农药类环境激素，回收率为65.6%～98.9%，相对标准偏差为6.2%～11.3%，检出限<10 μg/kg。应用液相色谱串联质谱联用法进行水产品中环境内分泌干扰物残留的检测见表4。

表4 水产品中环境内分泌干扰物残留的液相色谱串联质谱联用法检测实例Tab.4 Examples of EDCs residue detection in fishery products with LC-MS/MS

(续表4)

2.3 免疫分析法

免疫分析法是利用抗体和抗原特异性的结合对残留的污染物进行检测分析的方法，不需要昂贵的仪器设备，并且对操作人员的技术要求不高，具有便捷、快速、特异性强和灵敏等特点。环境内分泌干扰物的检测方法常用放射免疫测定法和酶联免疫吸附法。鱼中卵黄蛋白原是雌二醇在雌二醇循环过程中产生的，其含量代表生殖内分泌系统状态的综合指标，同时被用作监测环境内分泌干扰物的重要生物标志物[53]。Lim等[54]开发了酶联免疫吸附法检测雌激素的结合受体卵黄蛋白原用以检测鱼血清中环境内分泌干扰物的含量，主要是通过卵黄蛋白单克隆抗体和多克隆抗体来检测卵黄蛋白原，回收率达95%。Beitel等[55]采用酶联免疫吸附法定量北美本地鱼类血浆中11-酮睾酮和17-雌二醇，用以评估环境内分泌干扰物对鱼类中类固醇激素生成的影响。徐美奕等[56]采用放射免疫法测定湛江海域养殖的5种常见鱼肌肉中的5种激素的残留量，并与野生鱼类比较，发现养殖鱼中均有检出且含量均高于野生鱼。Metcalfe等[57]采用酶联免疫吸附法检测3种不同种类的鱼类血液中内固醇激素，其回收率为90%～120%，相对标准偏差低于10%，此方法可用于鱼类中激素的快速筛查。但由于通过抗原和抗体的特异性结合的方式实现分析检测，不适用于同时检测分析多种目标物。水产品中由于富含脂肪，极易影响抗原和抗体的特异性反应，故低含量样品的精准定量还需要借助灵敏度高的大型仪器检测。

3 展望与未来

由于渔药的不科学不合理使用、工业生产原料的大量使用以及生活和农业污水的排放，使得养殖水环境中环境内分泌干扰物含量持续积累。近年来的研究显示，极低含量的内分泌干扰物已会严重影响生物体的健康，长期积累到一定量将导致机体不可逆的损害。水产品中环境内分泌干扰物残留的检测已成为监测水产品质量安全的重要手段。由于数量和种类的逐渐增多，有效准确地检测水产品中残留的环境内分泌干扰物也愈加具有挑战性。因此开发和建立简便、快速、高效的前处理技术，以及高灵敏度和高通量快速筛查水产品中环境内分泌干扰物多残留的检测分析方法是发展的必然趋势。

前处理方法是环境激素检测的重要基础，经过多年的发展，目前国内外对水产品中残留环境内分泌干扰物的前处理新的提取手段如乙腈—水双水相萃取、亚临界萃取、固相微萃取、QuEChERs等方法已逐渐取代索氏提取、液液萃取和超声波萃取等耗时长、污染大的传统提取方法，简单、便捷、成本低、高通量的多组分同时提取净化技术将是未来前处理技术发展的方向，以满足社会日益增长的对环境监测准确、及时、方便的需求。

目前对水产品中残留环境内分泌干扰物的检测分析以色谱法、质谱法为主要手段，因气相色谱质谱法、气相色谱串联质谱联用法和液相色谱串联质谱联用法具有较高灵敏度而得到了广泛的应用，但受限于仪器价格昂贵、操作复杂且不易携带，并未广泛应用于现场快速检测。免疫分析法等生物检测方法因其具有快速、灵敏、高效、适宜现场检测等特点，将会在未来更多地应用在环境激素现场检测等方面。同时，为了应对不断增多的环境激素种类，开发研究新的检测方法和技术也具有重要意义。

当然，水产品的质量安全仅靠养殖过程中和过后的监测还远远不够。探明水产品中环境内分泌干扰物的污染来源，从根源上查明此类物质在水产养殖方面的使用也是重要的控制手段。应倡导绿色生态养殖业的发展，定期监管饲养环境中环境内分泌干扰物的水平，加强流通环节水产品的质量检测，从水产品产业链的源头上控制环境内分泌干扰物的污染，促进我国水产养殖业的健康持续发展。