重组酶快速检测十足目虹彩病毒1方法的建立

尹伟力，吴 葳，刘晓静，马晓玲，韩 伟，吴宁宁，陈燕平

(1.烟台海关技术中心，山东 烟台 264000；2.武汉农业检测中心，湖北 武汉 430016；3.荣成海关，山东 荣成 264300；4.上海医药集团 青岛国风药业股份有限公司，山东 青岛 266000；5.青岛海关技术中心，山东 青岛 266000)

2014年9月，浙江省养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)暴发了一种高死亡率的新疫病，患病虾出现虾壳变软、颜色变淡，空胃，伴随肝胰腺萎缩[1]。经中国水产科学研究院黄海水产研究所研究表明，这种疾病是由一种新发现的虹彩病毒引起的，命名为十足目虹彩病毒1(Decapodiridescentvirus1，DIV1)[2-3]，旧称为虾血细胞虹彩病毒(SHIV)。对主要衣壳蛋白(MCP)和ATP酶的氨基酸序列分析，该病毒属于虹彩病毒科下的一个新属[4]。流行病学调查结果显示，十足目虹彩病毒1也可感染中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)和罗氏沼虾(Macrobrachiumrosenbergii)[5-6]。近年来，该病已蔓延至我国沿海部分地区，并有加速扩散趋势，若未有效防控，将成为严重影响我国虾类养殖业发展的疫病之一。

虾类疫病的传统检测方法是PCR[7]，但该方法需要专用扩增仪器，不适合基层及现场快速检测。近来，愈来愈多操作简便、检测周期短的分子生物检测技术广泛应用于十足目虹彩病毒1，其中，重组酶聚合酶扩增技术(RPA)发展较为迅速。该技术无需造价高昂的升降温仪器，在恒温条件下20 min内即可完成核酸扩增，反应快速而灵敏，扩增产物可以通过构建荧光探针法进行实时定量检测，也可以与DNA芯片、琼脂糖凝胶电泳、侧流层析试纸条等多种检测技术相结合进行检测[8-10]，适合基层实验室及一线口岸的现场检测。笔者根据十足目虹彩病毒1保守序列ATP酶基因设计了一对特异性引物，基于重组酶聚合酶扩增技术，建立一种操作简便、检测时间短、特异性好、灵敏度高的仅需普通恒温设备的十足目虹彩病毒1检测方法，适用于一线口岸实验室的现场检测，可以有效对十足目虹彩病毒1进行早期监控及日常检测。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

白斑综合征病毒(WSSV)泰国株由本实验室保存，十足目虹彩病毒1、传染性皮下造血器官坏死病毒(IHHNV)广西株、Taura综合征病毒(TSV)ZHZC3 株、黄头病毒基因1型(YHV-1) Qingdao201603 株由广西水产研究科学院提供。

2016—2018年，共采集国内养殖虾样品509批，每批至少30尾。虾类主要有中国明对虾、斑节对虾(Penaeusmonodon)、罗氏沼虾、凡纳滨对虾。采集虾苗、幼虾和成虾，取每尾虾的鳃、血淋巴、胃部和腹部肌肉。

DNA和RNA提取试剂盒(西安天隆科技有限公司)；质粒DNA抽提试剂盒、Pmd18-T载体、DL2000 Marker、PCR Master Mix[宝生物工程(大连)有限公司]；重组酶及聚合酶试剂盒(北京强欣博瑞生物科技有限公司)。

1.2 引物设计

登录GenBank，根据已发表的十足目虹彩病毒1的ATP酶基因(KY681040)保守序列，参照重组酶聚合酶扩增技术引物设计要求[11-12]设计引物，上下游引物序列如下：

上游引物S1:5′-GACAGGAGAGGGAAATAACGGGAAAACGGT-3′(KY681040中318～347位点)；下游引物S2:5′-ATTTGGTTCATCCATGACTGCCCATCTAACA-3′(KY681040中471～501位点)。预期扩增条带为184 bp。采用中国水产科学研究院黄海水产研究所的巢式PCR的引物，进行巢式PCR。

第1轮PCR引物:F1,5′-GGGCGGGAGATGGTGTTAGAT-3′;R1,5′-TCGTTTCGGTACGA AGATGTA-3′。第2轮PCR引物:F2,5′-CGGGA AACGATTCGTATTGGG-3;R2,5′-TTGCTTGA TCGGCATCCTTGA-3′。上述引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.3 重组酶聚合酶扩增技术的优化

构建50 μL重组酶聚合酶扩增技术反应体系：向含有重组酶及聚合酶的反应管中加入25 μL(2×)反应缓冲液、浓度为5 μmol/L的上下游引物S1、S2各4 μL，加入模板DNA 2.0 μL，加入双蒸水至总体积为47.5 μL后混合均匀，加入2.5 μL浓度为280 mmol/L的醋酸镁溶液后充分混匀。试验共设置25、30、35、40、42 ℃ 5个温度梯度，探寻最优反应温度，同时设置空白对照。将待优化样品放置于金属浴内，37 ℃条件下，反应时长为30 min，经琼脂糖电泳分析扩增产物确定最佳反应温度。以相同反应体系，在最优反应温度条件下优化反应时间，恒温孵育15、20、25、30 min，产物经电泳分析确定最优反应时间。最终确定完整的重组酶聚合酶扩增技术反应体系。

1.4 G基因重组质粒的构建与鉴定

参照文献[13]设计的扩增十足目虹彩病毒1 ATP酶基因的引物进行PCR扩增，将扩增目的片段进行胶回收，纯化后连接pMD18-T载体构建重组质粒pMD18-S，将构建好的阳性质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列分析鉴定。测定pMD18-S质粒含量，计算拷贝数。

1.5 重组酶聚合酶扩增技术特异性试验

利用DNA提取试剂盒提取十足目虹彩病毒1、白斑综合征病毒、传染性皮下造血器官坏死病毒病毒株的DNA；利用RNA提取试剂盒提取Taura综合征病毒、YHDV-1，以RNA逆转录获得cDNA。以上述DNA、cDNA作为模板，利用建立的重组酶聚合酶扩增技术方法进行检测，对该方法的特异性进行评价。

1.6 重组酶聚合酶扩增技术灵敏度试验

以倍比稀释的重组质粒pMD18-G作为模板进行重组酶聚合酶扩增技术反应，确定该方法的敏感性。同时采用中国水产科学研究院黄海水产研究所设计的巢式PCR[6]对重组质粒进行PCR，比较两种方法的检测结果。

1.7 临床样品的检测

采集自养殖场的样品中，整个虾苗被用作样本；幼虾和成虾取鳃等组织均匀化以提取DNA，利用建立的重组酶聚合酶扩增技术进行检测。50 μL反应体系，其中25 μL反应缓冲液(2×)、上下游引物S1、S2(5 μmol/L)各4 μL以及2.0 μL 样品DNA，用双蒸水补至总体积为47.5 μL后充分混匀，加入2.5 μL 280 mmol/L醋酸镁溶液并混合均匀。同时利用巢式PCR方法检测，比较二者结果。

引物F1和R1进行第1轮PCR，反应体系：PCR Master Mix 12.5 μL，引物 F1 (10 pmol/μL)和R1 (10 pmol/μL)各1 μL，样品DNA 2 μL，加ddH2O至25 μL。反应程序:94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 50 s，共36个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃保存。第1轮PCR预计目标条带为457 bp。

第1轮的产物稀释100倍后作为第2轮的模板。使用第2轮PCR的特异性引物F2和R2再次进行PCR。反应体系和程序与第1轮PCR一致。反应结束后产物经电泳分析预测目标条带为129 bp。

2 结 果

2.1 ATP酶基因重组质粒的构建

以十足目虹彩病毒1基因组DNA为模板扩增ATP酶基因，提取扩增片段后纯化，连接载体转化，对重组质粒pMD18-S进行筛选，重组质粒经PCR扩增鉴定，结果显示，扩增出一条约1200 bp的片段，与设计相符，表明成功构建了重组质粒pMD18-S。用核酸蛋白检测仪测定pMD18-S的含量，根据公式计算出拷贝数为7.0×1010拷贝/μL(图1)。

图1 ATP酶基因重组质粒的PCR鉴定结果Fig.1 Identification of recombinant plasmid ATPase gene by PCRM.DL2000;1.ATP酶基因;2.阴性对照.M.DL2000;1.ATPase gene;2.negative control.

2.2 十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术建立

设置5个温度梯度，用以摸索最佳反应温度。扩增结果显示，温度为25～42 ℃时，均可以扩增出184 bp的特异性目的条带。扩增温度设置为35、40、42 ℃时，由图2a可见，除目的条带外，还出现了微弱的非目的条带。扩增温度为25 ℃时扩增的目的条带不如30 ℃的扩增条带明亮，因此十足目虹彩病毒1的最佳扩增温度最终确定为30 ℃。在30 ℃下重组酶聚合酶扩增反应，20 min反应时间特异性条带比15 min更清晰明亮，因此20 min为十足目虹彩病毒1的最优扩增时长(图2b)。

图2 十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术优化试验Fig.2 Optimization test of RPA for DIV1a:M.DL2000;1.阴性对照negative control;2.25 ℃;3.30 ℃;4.35 ℃;5.40 ℃;6.42 ℃.b:M.DL2000;1.阴性对照negative control;2.15 min;3.20 min;4.25 min;5.30 min.

2.3 重组酶聚合酶扩增技术的特异性试验

运用建立的重组酶聚合酶扩增技术对十足目虹彩病毒1、白斑综合征病毒和传染性皮下造血器官坏死病毒的DNA，以及Taura综合征病毒和黄头病毒基因1型cDNA进行检测，结果显示，只有十足目虹彩病毒1在约184 bp处出现明显的特异性条带，其余4种病毒均未出现特异性扩增条带(图3)。表明所建立的重组酶聚合酶扩增技术检测方法具有较好的特异性。

图3 十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术特异性试验Fig.3 The specificity results of recombinase polymerase amplification technology(RPA) for DIV1 by RPAM.DL2000;1.十足目虹彩病毒1;2.白斑综合征病毒;3.传染性皮下造血器官坏死病毒;4.Taura综合征病毒;5.黄头病毒基因1型;6.阴性对照.M.DL2000;1.DIV1;2.WSSV;3.IHHNV;4.TSV;5.YHV-1;6.negative control.

2.4 重组酶聚合酶扩增技术与PCR方法灵敏度试验

以倍比稀释的重组质粒pMD18-G(7.0×104～7.0×100拷贝/μL)为模板，进行灵敏度试验，并与巢式PCR方法进行比较，结果显示重组酶聚合酶扩增技术的检测限为7拷贝/μL，远高于巢式PCR方法的检测限70拷贝/μL(图4)，表明重组酶聚合酶扩增方法比PCR方法灵敏度高。

图4 重组酶聚合酶扩增技术(a)与PCR(b)敏感性对比试验Fig.4 Sensitivity test of RPA(a) compared with PCR(b)M.DL2000;1.7.0×104拷贝/μL;2.7.0×103拷贝/μL;3.7.0×102拷贝/μL;4.7.0×101拷贝/μL;5.7.0×100拷贝/μL;6.阴性对照.M.DL2000;1.7.0×104copies/μL;2.7.0×103 copies/μL;3.7.0×102 copies/μL;4.7.0×101 copies/μL;5.7.0×100copies/μL;6.negative control

2.5 临床样品的检测

用建立好的重组酶聚合酶扩增技术法与巢式PCR方法对本实验室采集的509份临床样品进行检测。对比结果显示，十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术法与巢式PCR法的检测结果相同，共检测出13份阳性样品，但巢式PCR检测结果出现了2份弱阳性样品(表1)，结果表明，十足目虹彩病毒1重组酶聚合酶扩增技术法可有效地检出巢式PCR方法的弱阳性样品，因此十足目虹彩病毒1重组酶聚合酶扩增技术法的灵敏度高于巢式PCR方法。

表1 重组酶聚合酶扩增技术法(RPA)和巢式PCR方法对临床样品检测结果Tab.1 The detective result comparison of clinical samples by RPA and nested-PCR methods

3 讨 论

3.1 重组酶聚合酶扩增技术的特异性试验

十足目虹彩病毒1作为国内新流行的虾类疫病病原，是口岸检疫的重要检疫对象。因为虾类病毒无法进行细胞培养，分子生物学技术成为主要检测方法，如PCR、环介导等温扩增等成为检测虾类病毒的主要检测技术。这些方法还存在一些不足，PCR需要价值较高的变温扩增仪，某些基层实验室条件无法满足，并且检测周期较长，扩增时长约2～3 h；而环介导等温扩增法需要设计2～3组引物，引物之间容易产生二聚体，造成结果假阳性[14-16]。与传统核酸扩增技术相比，重组酶聚合酶扩增技术检测周期短，0.5 h内即可完成，无需变温扩增仪，使用恒温水浴锅等普通设备即可完成，检测灵敏度高，结果判定简单、形式多样化[17]。作为新发展起来的恒温扩增技术，近些年被应用于多种领域，如转基因检测、病原微生物检验、动物致病病原体检疫等。邓婷婷等[18]利用重组酶聚合酶扩增技术，建立了Cry1Ab/c基因的37 ℃恒温快速检测方法，可以鉴别转基因水稻；刘立兵等[19]建立了可以在38 ℃恒温条件下快速检测猪细小病毒的重组酶聚合酶扩增技术。重组酶聚合酶扩增技术最佳反应温度在25～42 ℃，本试验设置了25、30、35、40、42 ℃ 5个温度梯度，对比各个温度的扩增结果，确定30 ℃为最佳反应温度。在确定最优反应温度后，设计了15、20、25、30 min 4个反应时间，结果表明，20 min反应时间特异性条带比15 min更清晰明亮，因此20 min为十足目虹彩病毒1的最优扩增时长。

3.2 重组酶聚合酶扩增技术的特异性试验

引物设计是重组酶聚合酶扩增技术设计的核心。不同于PCR引物的设计，重组酶聚合酶扩增技术引物没有专门的生物软件，只可人工比对序列，在保守区域设计[20]。重组酶聚合酶扩增技术引物设计一般遵循以下几个规律：一是重组酶聚合酶扩增技术引物长度不多于45 bp，最优碱基数为30～35 bp，引物碱基数太少会影响与重组酶的结合，降低了扩增速度，但是碱基数大于45 bp的引物设计时会出现引物发夹、连续序列的重复、回文序列等问题，造成引物设计失败[21-22]；二是扩增目的片段长度的选择，重组酶聚合酶扩增技术目的片段通常长度在80～400 bp，100～200 bp之间的片段扩增效果最佳，灵敏度高，特异性好[23-24]。

3.3 重组酶聚合酶扩增技术的特异性和灵敏度

笔者根据十足目虹彩病毒1的ATP酶基因保守区域的序列设计了引物，建立了十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术快速、准确的检测方法。该方法在30 ℃效果最优，无需昂贵的变温仪器；20 min反应即可完成检测，相比常规的PCR方法，大大缩短了检测时间，提高检测效率；该方法对十足目虹彩病毒1的最低检出限为7 拷贝/μL，比巢式PCR 70拷贝/μL的最低检出限灵敏。夏小明[25]基于重组酶聚合酶扩增技术，建立了白斑综合征病毒和传染性皮下造血器官坏死病毒的重组酶聚合酶扩增技术快速检测方法，最低检出限分别为10拷贝/μL和4 拷贝/μL，与本试验的检出限类似，说明重组酶聚合酶扩增技术在水生动物病毒最低检出限基本约为10拷贝/μL。利用本试验建立的方法对国内养殖场采集的509份临床样品进行重组酶聚合酶扩增技术检测，采集样品种类涉及国内养殖最多的中国明对虾、斑节对虾、罗氏沼虾、凡纳滨对虾等虾类，其中凡纳滨对虾阳性率最高(6/293)。将重组酶聚合酶扩增技术法检测的结果与巢式PCR法进行比较，重组酶聚合酶扩增技术法可以有效地检出巢式PCR法的弱阳性样品，且其余样品重组酶聚合酶扩增技术法与巢式PCR法的检测结果一致，证明重组酶聚合酶扩增技术检测的灵敏度高于巢式PCR，避免假阳性结果的出现。巢式PCR检测出的弱阳性样品因为扩增产物含量较低，无法进行测序分析，从而不能确定样品检测结果是否为阳性。

4 结 论

本试验建立了十足目虹彩病毒1的重组酶聚合酶扩增技术快速检测方法，20 min反应即可完成检测，最低检出限为7 拷贝/μL。该方法快速灵敏、特异性好、操作简便，适用于基层养殖单位和一线口岸的现场检测。