斑马鱼在心血管病治疗药物筛选研究中的应用

胡杨兮 油红敏 任昌振 张艳达 梁春

1 概述

斑马鱼(zebrafish)又名蓝条鱼、花条鱼、印度鱼，属辐鳍鱼纲鲤形目鲤科，多生活于中亚和南亚的热带地区。斑马鱼成鱼身体呈纺锤形，长度为3～5 cm，头尖吻短，因体表有银白或金黄与蓝色相间排列的花纹，形似斑马而命名。斑马鱼作为一种新型的模式动物，广泛应用于组织发育[1]、心血管系统疾病[2]以及肿瘤[3]等领域的研究。相比其他经典的模型动物，斑马鱼有独特优势：(1)性成熟周期短，产卵量大。斑马鱼性成熟约3个月，母鱼每周产卵达200枚。(2)可视性好。斑马鱼胚胎及幼鱼通体透明，便于活体观察心脏、血管的实时状态并进行实验操作。(3)转基因鱼系丰富。科研人员通过基因编辑技术构建了多种心血管系统组织特异性的荧光鱼系，如Tg(fli1∶EGFP) 转基因鱼系用绿色荧光标记血管内皮细胞、Tg(myl7∶EGFP)鱼系用绿色荧光标记心肌细胞、Tg(gata1∶mcherry)鱼系用红色荧光标记红细胞等，极大提高了斑马鱼在心血管系统发育和疾病研究中的地位。心血管病治疗药物的研发需要进行短周期、高通量的筛选。许多药物需要在体内转化为有效的活性形式才能发挥作用，经典的小鼠等动物模型和细胞模型不能满足筛选研究的需要。2008年Yu等[4]利用斑马鱼模型筛选出激活素受体样激酶(Alk)的第一个小分子拮抗剂多索吗啡(Dorsomorphin),其可以作用于血管内皮生长因子(VEGF)受体，从而阻断血管生成[5]。转基因斑马鱼体量小、繁殖快及可视性等特点，使其成为在体药物筛选研究的优选[6]。

2 斑马鱼与心血管病治疗药物筛选研究

2.1 血管新生调节药物的筛选

斑马鱼模型在血管新生调节药物的筛选研究中广泛应用，在筛选有效药物的同时也发现众多精准调控斑马鱼血管发生的小分子及其相应受体介导的信号通路。较常用的是以荧光蛋白标记血管内皮细胞的转基因鱼系Tg(fli1∶EGFP)和Tg(fli1∶nEGFP)等。有研究者利用药物干扰斑马鱼血管新生过程，再对促进血管损伤修复的药物进行筛选，如利用酪氨酸酶抑制剂诱导幼鱼血管损伤后，用黄芪多糖处理可以显著修复损伤[7]。利用Tg(fli1∶EGFP)、Tg(fli1∶nEGFP)鱼系对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行研究，发现毛蕊异黄酮[8]和降香提取物[9]通过上调VEGF受体表达，促进幼鱼血管新生和节间血管损伤修复。Liu等[10]对用地黄提取物处理Tg(fli1∶EGFP)胚胎的肠下血管(SIV)新生长度和出芽数量进行统计，发现地黄提取物中的二氯甲烷、咖啡酸等物质也具有促进血管新生的作用。知母皂苷BⅡ具有促血管新生和修复受损血管的作用，其机制可能是使VEGF受体和促炎性细胞因子(如白细胞介素-6)的表达上调[11]。

利用转基因斑马鱼可以对成分复杂的中药方剂进行快速筛选研究。Tse等[12]发现地黄与黄芪配伍可通过上调VEGF-A及类激酶插入区受体(Kdrl)的表达，促进幼鱼节间血管过度生长。麝香保心丸有效成份之一的肉桂醛可部分改善由VEGF受体抑制剂瓦他拉尼二盐酸盐诱导的斑马鱼幼鱼节间血管的缺失[13]。

2.2 调脂药物的筛选

斑马鱼的脂质代谢过程与哺乳动物相似，高胆固醇饮食可诱导斑马鱼的脂蛋白氧化、血管内脂质堆积、免疫细胞迁移等早期动脉粥样硬化征象。利用斑马鱼构建脂代谢紊乱的疾病模型可用于高脂血症、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病等的机制研究和药物筛选。Han等[14]报道小檗胺可以显著降低高胆固醇饮食斑马鱼的血浆脂肪含量，伊折麦布则可显著改善脂质在斑马鱼血管内的堆积[15]。Littleton等[16]利用脂代谢紊乱斑马鱼幼鱼模型发现山楂叶和山楂花可明显降低斑马鱼血浆低密度脂蛋白水平，抑制胆固醇的吸收，提高心输出量。用枇杷叶提取物处理脂代谢紊乱斑马鱼模型后发现斑马鱼血浆中总胆固醇和三酰甘油水平降低，提示枇杷叶有抗动脉粥样硬化作用[17]。研究发现，姜黄和月桂的水提取物也可抑制斑马鱼胆固醇酯和低密度脂蛋白活性[18]，进而抑制动脉粥样硬化和糖尿病的进展。除了检测血脂，还可以通过其他方法探究药物对斑马鱼脂代谢的影响。如制首乌及大黄素还可显著降低斑马鱼的体质量、体长，并减轻肝脏中的脂质沉积，其机制可能是通过上调磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、丝氨酸/苏氨酸激酶2(AKT2)、一磷酸腺苷激活的蛋白激酶α(AMPKα)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)、肉碱棕榈酰转移酶1a(CPT-1a)和酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)的表达，从而减少肝脏脂质合成[19]。白藜芦醇虽然未明显改变斑马鱼血浆中脂质含量和体质量、体长，但能明显改善肝脏脂肪浸润，提示其可能存在长效调脂作用[20]。

2.3 抗炎药物的筛选

许多心血管病与炎性反应密切相关，如动脉粥样硬化、血管炎以及结缔组织病的心血管系统病变等。目前已构建大量特异荧光标记炎性细胞的转基因鱼系模型[21]，如用绿色荧光标记中性粒细胞的Tg(lyz∶EGFP) 转基因鱼系、用红色荧光标记巨噬细胞的Tg(coro1a∶mCherry)鱼系等，可实时、动态观察在心肌细胞或血管内皮细胞受到损伤后发生炎性反应，或使用抗炎药物后对特定炎性细胞的分化、分布等方面的影响。Luo等[22]对荧光标记中性粒细胞和血管内皮细胞的Tg(lyz∶EGFP;flk1∶mCherry)转基因鱼系喂养高胆固醇饮食，证实高胆固醇饮食诱导斑马鱼的血管内皮炎性反应早于血管内中性粒细胞的募集和脂质沉积，且在动脉粥样硬化的初始阶段中性粒细胞募集早于脂质沉积。另外，用脂多糖处理斑马鱼胚胎可构建急性炎性反应斑马鱼模型。Fan等[23]利用绿色荧光标记中性粒细胞、红色荧光标记巨噬细胞的Tg(coro1a∶mCherry;lyz∶dsRed) 转基因鱼系构建急性炎性反应模型，并对斑马鱼尾鳍进行部分切除，发现毛竹黄酮处理的斑马鱼模型的切口处中性粒细胞和巨噬细胞的募集显著减少。研究发现，利用特异荧光标记淋巴中性粒细胞和心肌细胞的转基因鱼系，在反复发生冷冻损伤后心肌恢复能力降低，这与中性粒细胞的募集增强和再生心肌细胞早期增殖和去分化减少有关[24]。组胺在多种炎性反应中大量释放，有研究发现用组胺H1受体拮抗剂处理用特异荧光标记心肌细胞的Tg(cmlc2∶mCherry)转基因斑马鱼胚胎，可引起胚胎心脏早期发育异常[25]。还有研究发现干巴菌主要成分之一的菌丝体锌多糖-2(MZPS-2)可清除斑马鱼模型的自由基，减少由炎性反应引起的活性氧的生成，并抑制中性粒细胞向损伤部位的聚集。

2.4 抗心肌损伤药物的筛选

Li等[26]将用特异荧光标记血管内皮细胞的Tg(kdrl∶mCherry)和用特异荧光标记心肌细胞的Tg(myl7∶GFP)转基因斑马鱼暴露于拟除虫菊酯杀虫剂溴氰菊酯，联用褪黑素和丹参酮ⅡA磺酸钠可以显著减轻溴氰菊酯引起的心血管毒性和睡眠唤醒，同时相关基因的表达恢复到正常水平。酒精可引起斑马鱼胚胎体长缩短和心脏水肿，而白藜芦醇对酒精引起的斑马鱼胚胎心脏有保护作用[27]。阿霉素对斑马鱼心脏收缩力和心率有明显的负性作用，可导致斑马鱼胚胎心脏出血，心搏减弱甚至停跳；丹参的天然产物二氢丹参酮可减轻阿霉素对斑马鱼幼鱼的心脏毒性，提高心脏收缩功能、促进尾静脉血流[28]。

2.5 其他心血管病治疗药物的筛选

在抗血栓药物筛选方面，利用花生四烯酸可在绿色荧光标记血红蛋白的Tg(LCR∶EGFP)斑马鱼上建立血栓模型。Qi等[29]发现丹红注射液的主要成分(丹参、红花、迷迭香酸和对香豆酸等)均有抗血栓形成作用。Sheng等[30]利用苯肼在绿色荧光标记成熟血小板的Tg(CD41∶EGFP)和Tg(LCR∶EGFP)转基因斑马鱼上建立血栓模型，发现通脉的主要化学成分——隐丹参酮具有显著的抗血栓作用。Zuo等[31]利用苯肼诱导的斑马鱼血栓模型，发现丹参可直接与凝血途径调控靶点中的凝血酶、凝血因子Ⅹa和环氧合酶-1发生反应，而川芎可以特定的比例与丹参配伍，发挥协同抗血栓作用。在抗心律失常药物筛选方面，Liu等[32]利用特非那定在Tg(cmlc2∶GFP)斑马鱼胚胎上建立心律失常模型，发现稳心颗粒中提取的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、三七皂苷R1、党参炔苷和党参提取物Lobetyolinin等化合物具有抗心律失常作用。

多种药物可通过诱导心肌损伤构建心力衰竭斑马鱼模型。异丙肾上腺素诱导的慢性心力衰竭模型中斑马鱼出现心率降低，心室腔面积增大，射血分数降低和心包水肿[33]。利用特定浓度的阿奇霉素处理斑马鱼胚胎3 d后，胚胎可出现心率降低和心输出量减少[34]，而雷公藤红素处理的斑马鱼胚胎会发生心脏畸形及出血[35]。Huang等[36]发现马兜铃酸可使幼鱼心脏肌节聚集、肌纤维破坏和内皮细胞数量减少，从而使幼鱼出现心率减低、循环减慢或停止、血管淤血水肿等。

3 小结

斑马鱼模型极大地推动了心血管病药物的高通量筛选研究。利用斑马鱼模型进行药物筛选研究的规模大，效率高，成本低，有巨大的应用潜力。目前基于斑马鱼模型建立的心血管病治疗药物筛选平台的应用多集中于血管新生、脂代谢、心脏毒性等方面，而心律失常、心肌代谢病、高血压等疾病的斑马鱼模型和治疗药物筛选平台还有待完善。另外，现阶段利用斑马鱼模型进行药物筛选时一般是将药物溶于培养水，无法精确定量个体摄入量和血药浓度，可能导致实验结果偏倚。