SARS-CoV-2核酸复阳患者临床特点及不同标本核酸检测结果分析

姜 芬，丁 坤，李绍先，徐 军，徐艳丽

2019新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019,COVID-19）疫情在全球200多个国家和地区持续暴发[1-2]，病原体为严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2），属β冠状病毒[3]。是继中东呼吸综合征冠状病毒和严重急性呼吸综合征冠状病毒之后的第三种引起人类严重呼吸道疾病的人畜共患病冠状病毒，也是近20年来第一种引发全球大流行的冠状病毒。

对潜伏期患者、无症状感染者SARS-CoV-2脱落和播散的研究[4-5]以及从粪便中持续检出SARSCoV-2的报道引发了相关研究者对该感染性疾病管理控制的广泛关注[6-7]。某些COVID-19患者病毒核酸检测出现复阳现象，尽管大多推测与检测灵敏度有关[8]，但亦可能与病毒载量低或病毒脱落规律不同有关。据统计，在出院患者中病毒核酸检测在短暂连续2次或以上阴性后复阳的患者数占出院患者总数的21.4%[9]；此外，超过20.0%的患者在呼吸道标本病毒核酸转阴后，其粪便标本的病毒核酸检测仍呈阳性[10]，部分出院患者胃肠道标本中病毒核酸检测持续阳性[11]。推测SARSCoV-2可能通过粪-口途径传播，增加了二次传播的风险，也解释了医院感染的原因，如何根据各类患者特征进行针对性管理和预防控制尤为重要。本研究对COVID-19出院患者鼻咽拭子和粪便标本病毒脱落时间进行随访，以评价复阳患者的临床特征和病毒转阴时间，以期为COVID-19患者管理控制提供针对性指导意见。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2019年1月15日—2020年2月10日烟台市奇山医院收治的43例COVID-19确诊患者为研究对象。根据住院期间是否出现鼻咽拭子或痰液标本病毒核酸检测复阳，将患者分为复阳组（n=15）与未复阳组（n=28）。出院后隔离期间每4～7 d复查鼻咽拭子和粪便标本病毒核酸，因患者咳痰症状均已消失，遂出院随访未采集痰液标本。本研究符合1975年赫尔斯基宣言并经过医院伦理委员会审查同意。

1.2 方法 收集所有研究对象的一般资料及临床特征、实验室检查结果、治疗措施（包括抗病毒、免疫调节剂、呼吸支持、抗生素治疗等）、流行病学史资料以及病毒核酸检测结果。所有患者均按照国家卫生健康委员会发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》[12]进行诊断和治疗；采用实时荧光反转录-聚合酶链反应（reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR）进行SARS-CoV-2核酸检测。

1.3 相关定义及标准 患者出院标准：①体温恢复正常3 d以上（不使用皮质类固醇或退热剂）；②呼吸道症状明显好转；③肺部影像学显示炎症明显吸收；④连续2次呼吸道标本SARS-CoV-2核酸检测阴性（采样时间间隔≥24 h）。初始病毒核酸转阴时间：SARS-CoV-2核酸检测至少2次连续阴性结果中首次阴性的时间。病毒核酸复阳患者：在至少连续3次病毒核酸检测阴性后（采样时间间隔＞24 h），再次出现病毒核酸阳性者。病毒最长脱落时间：从发病之日起至连续2次病毒核酸检测阴性之日为止，且在至少2周的随访期间未出现核酸检测阳性结果。其中，对于病毒核酸复阳患者，病毒最长脱落时间为从发病之日起至随访期间最后一次SARS-CoV-2核酸检测呈阳性之日。间断阴性状态：连续2次或以上病毒核酸RT-PCR检测为阴性后病毒核酸复阳之前的状态，时间计算为从第1 d核酸检测为阴性到连续阴性检测结束。实验室检测指标正常参考值：白细胞计数（3.5～9.5）×109/L、中性粒细胞计数（1.8～6.3）×109/L、淋巴细胞计数（1.1～3.2）×109/L、血小板计数（125～ 350）×109/L、CRP 0～5 mg/L、血清淀粉样蛋白A（serum amyloid A,SAA）＜10 mg/L。

1.4 标本采集 采集患者鼻咽拭子、痰和粪便标本，并将样本存放于2～8 ℃的病毒转运介质中。痰液标本，鼓励患者严重咳嗽，将痰液收集到一次性无菌旋转盖取样杯中，加入2 ml蛋白酶K（1 g/L），30 min内进行病毒核酸检测；血清样本收集于血清分离管中进行离心操作。

1.5 SARS-CoV-2核酸检测 使用QIAamp病毒核酸迷你试剂盒试剂（德国凯杰）提取和纯化核酸。使用SARS-CoV-2核酸检测试剂盒（中山大学达安基因，中国广州）进行RT-PCR检测，针对SARS-CoV-2基因组的Orf1ab区域和N基因，使用QuantStudio 5 RT-PCR系统（美国应用生物系统公司）。阳性定义为2次独立重复试验至少1次成功扩增，周期阈值为40。中间阴性RT-PCR结果持续＜3 d或＜2次连续试验视为无效或假阴性结果[9]。患者入院后，每隔1 d采集鼻咽拭子标本和痰标本进行病毒核酸检测，直至患者符合出院标准。出院后每4～7 d收集患者鼻咽拭子标本和粪便标本，进行病毒核酸检测。

1.6 统计学处理 采用SAS 9.4软件进行数据分析。符合正态分布的计量资料用±s表示，组间差异比较采用t检验；非正态分布计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Mann-Whitney U检验。计数资料以例数（%）表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确检验。统计学检验均为双侧检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般特征 43例患者中男性22例（51.2%），女性21例（48.8%），中位年龄47.0（37.0，54.0）岁，入院时发病中位时间为3.0（2.0，6.0）d，住院中位时间为25.0（19.0，29.0） d，10例（23.3%）患者具有基础疾病史（高血压、糖尿病、支气管哮喘、溃疡性结肠炎、冠心病及贫血），5例（11.6%）患者为重症患者。所有患者均接受抗病毒药物（利托那韦/洛匹那韦）治疗；21例（48.8%）患者接受经验性抗生素治疗；41例（95.3%）患者从入院开始接受吸入IFN治疗（8000 U，2喷/次，3次/d）；12例（27.9%）患者CD4淋巴细胞计数异常下降，接受胸腺肽皮下注射治疗（1.6 mg，2次/周）；8例（18.6%）患者接受氧疗；经治疗后所有患者均完全康复。复阳组和未复阳组在年龄、性别、入院时发病时间、基础疾病史等方面差异均无统计学意义（P均＞0.05），复阳组患者住院时间更长（Z=0.425，P=0.016）。未复阳组患者接受抗生素治疗比例高于复阳组（P＜0.05）。详见表1。

表1 43例COVID-19患者的一般资料Table 1 General information of 43 COVID-19 patients

2.2 临床表现和实验室检查结果 43例患者最常见的症状为咳嗽（88.4%）、咳痰（79.1%）和发热（76.7%），上述症状的中位持续时间分别为18.0（8.0，26.0） d、10.5（5.0，20.0） d和7.0（3.5，10.5） d；大约1/3的患者伴有胸痛、焦虑/失眠等症状。入院时实验室检查结果显示25.6%患者白细胞计数减少，20.9%患者淋巴细胞计数下降，34.9%患者CRP水平升高，20.9%患者SAA水平升高。与未复阳组相比，复阳组患者均为普通型，最高体温更低，咳痰持续时间更短，ESR、CRP、SAA水平更低（P均＜0.05）。详见表2。

表2 43例COVID-19患者的临床表现和实验室检查结果[例(%)]Table 2 Clinical manifestations and laboratory test results of 43 COVID-19 patients[cases(%)]

2.3 实验室检查

2.3.1 呼吸道标本中SARS-CoV-2脱落时间 43例患者鼻咽拭子和痰液标本中SARS-CoV-2核酸转阴的中位时间分别为15.5（13.0，23.0）d和24.0（14.0，31.0）d，鼻咽拭子短于痰液样本。虽然2组患者鼻咽拭子标本病毒核酸初始转阴时间差异无统计学意义，但复阳组鼻咽拭子标本病毒最长脱落时间显著延长，痰液标本中病毒脱落时间较未复阳组也显著延长，差异均具有统计学意义，详见表3。住院期间复阳组患者中以鼻咽拭子标本复阳比例较高为93.3%（14/15），痰液标本病毒核酸较少出现复阳现象，仅1例。

表3 43例 COVID-19患者的病毒核酸检测/持续时间（d）Table 3 Viral nucleic acid test/duration of 43 COVID-19 patients(d)

2.3.2 粪便标本核酸检测结果及出院后随访 本研究中共采集了10例患者住院期间的粪便标本并进行SARS-CoV-2核酸检测，其中4例显示阳性，均为复阳组患者。更值得注意的是，这4例患者中，有3例在鼻咽拭子标本核酸检测结果转阴后粪便标本中仍能检测到病毒核酸。为进一步研究复阳患者病毒脱落模式，对康复患者鼻咽拭子和粪便样本病毒核酸进行追踪检测，发现共有7例患者治愈出院后经随访检测到病毒核酸阳性（5例粪便标本病毒核酸阳性，3例鼻咽拭子病毒核酸阳性），其中1例鼻咽拭子和粪便标本同时复阳。上述出院后随访病毒检测阳性者均为住院期间鼻咽拭子病毒复阳组患者，且患者粪便标本病毒核酸阳性持续时间最长可达出院后19 d。

2.4 胸部CT 典型COVID-19患者胸部CT表现呈双肺多发斑片状磨玻璃影。本研究中所有患者出院时胸部CT表现均有改善，而呼吸道标本SARS-CoV-2核酸复阳和粪便标本中病毒核酸持续阳性患者均未发现胸部CT较前改变。

3 讨 论

目前，SARS-CoV-2核酸检测复阳现象被认为是RT-PCR检测假阴性的结果[11]，但尚未排除其他可能性。牛卫东等[13]的研究表明痰液标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率远远高于咽拭子标本和鼻拭子标本。病毒脱落通常被视作传染性的标志[14]，研究表明，非危重患者呼吸道标本中SARS-CoV-2脱落中位时间约为18～20 d，下呼吸道比上呼吸道标本病毒脱落时间更长[15-19]。另有报道称约21.4%的患者在连续2次SARS-CoV-2核酸检测结果转阴后出现复阳，连续3次鼻咽拭子阴性的患者肺中仍然有SARS-CoV-2残留[9]。本研究中34.9%的患者在短暂的病毒核酸检测转阴后又复阳，且与未复阳组患者相比，该类患者多表现为轻度感染、轻度发热、咳痰时间短，痰液标本中病毒脱落时间较上呼吸道标本更长，粪便标本病毒核酸阳性率更高，与上述研究结果吻合。有研究结果显示，在患者肠道原位检测到病毒复制信号[20]或肠道高表达SARS-CoV-2感染所需受体[21]。根据本研究中病毒核酸复阳患者不同部位采集标本病毒清除时间、病毒持续脱落趋势特征，推测胃肠道存在病毒受体的可能。有学者将患者病毒核酸检测复阳现象归因于取样、RT-PCR检测假阴性和核酸转阴时间延长等因素，然而，病毒感染在某些靶细胞潜伏或与相应受体反应的可能性并没有被排除，这须要进一步研究病毒载量、分离测序病毒株等。

有研究报道，较高病毒载量、上呼吸道较长的病毒脱落时间与疾病严重程度有关[14，16，22]。本研究尚未发现病毒脱落时间延长与疾病严重程度相关的证据，恰恰相反，本研究中复阳组患者更多表现为轻症，且5例重症患者均未发生病毒核酸检测结果复阳的现象。考虑结论不一致的原因可能为多方面，首先，本研究中的复阳组并不能代表全部病毒清除延迟患者群体；其次，考虑慢性病毒脱落或病毒变异株产生[23-24]、机体适应性免疫应答变化等因素导致患者病毒核酸检测复阳或病毒清除延迟，而与疾病严重程度无关。

最近从COVID-19患者粪便样本中分离得到SARS-CoV-2的研究证实，该病毒可能通过胃肠道传播[25-28]，其他研究也发现57.1%的病毒核酸检测复阳患者在其粪便样本中检测出SARS-CoV-2核酸，且持续时间比呼吸道样本更长，病毒载量峰值出现更晚[29-31]。本研究中也存在部分复阳患者在其呼吸道样本中几乎检测不到病毒核酸的情况下，粪便标本依然呈现持续病毒核酸阳性，且无临床症状，与上述研究结果吻合，提示粪便标本病毒检测是判断患者出院和解除隔离的另一种可行性指标，特别是针对核酸检测复阳患者。另外，本研究中未发现粪便标本中病毒核酸检出率和持续时间与疾病严重程度、疾病进展的关系，与既往研究一致[32]，考虑可能与宿主免疫应答或胃肠道黏膜免疫有关[33]。

综上所述，SARS-CoV-2核酸复阳患者更可能表现为轻症感染，同时该类患者存在痰液标本病毒脱落延迟和粪便标本病毒核酸持续阳性的特点，因而对病毒核酸复阳患者应给予特别关注和更长时间的医学观察，以预防和控制疫情的再次传播。

当然，本研究也存在一定局限性，首先，本研究样本量较小，对COVID-19患者的治疗方案是经验性的，实施的药物干预特别是抗病毒药物和免疫调节剂对病毒排出的影响尚未确定被排除；其次，本研究未进行病毒载量和活病毒颗粒分离，不能从病毒核酸痕迹中得出具体的传染性结论；再次，未进行SARS-CoV-2的IgG或IgM抗体检测来描述不同标本阳性检测的精确时间窗。COVID-19作为一种新发传染病，我们对于SARSCoV-2在临床特征等方面的认识尚有不足，仍须进一步持续跟踪探究，用以指导临床、预后判断和和传播控制。