二甲双胍与利拉鲁肽对超重2型糖尿病患者肠道菌群的影响

邢 英，郑嵘炅，姜春晖，玛依拉·卡哈尔，木胡牙提·乌拉斯汉

截至2020年，我国糖尿病患者近1.3亿，其中2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus,T2DM）约占90%[1]。临床发现，超重与T2DM的发生发展具有密切联系[2]。而且，部分研究结果显示，超重及糖尿病发生与肠道菌群变化相关，肠道菌群作为主导人体健康的关键参与者[3]，影响宿主的营养、代谢及免疫，进而在糖尿病发生发展中发挥重要作用[4-5]。因此，肠道菌群结构及功能的研究有可能成为T2DM防治的重要突破口[6-8]。二甲双胍与利拉鲁肽均是当前临床用于治疗超重T2DM患者常用的有效药物[9]，但关于2种药物对患者肠道菌群结构和功能影响的研究较少。本研究拟采用高通量测序与生物信息学相结合的方法，探究2种药物对患者肠道菌群结构和功能的影响，为超重T2DM患者治疗方案的选择提供参考依据。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2018年1月—2019年6月于新疆医科大学第一附属医院综合内四科VIP病区住院的90例初治超重T2DM患者作为研究对象，平均年龄为（48±9）岁，其中少数民族患者8例。入选标准：①T2DM诊断符合糖尿病诊断标准[10]；②身体质量指数（body mass index,BMI）≥27.5 kg/m2[11]。排除标准：①年龄＜18岁；②长期吸烟、酗酒；③患有炎症、肿瘤、溃疡等肠道器质性疾病；④具有腹部手术史；⑤具有恶性高血压、严重高脂血症、自身免疫性疾病病史；⑥处于妊娠期和哺乳期；⑦近2周内使用解痉药、膨胀剂、益生菌、抗菌药物或近1月内使用激素类药物、质子泵抑制剂及中成药；⑧二甲双胍及利拉鲁肽不耐受。本研究已通过我院伦理委员会审核批准（伦理审查批件编号：20201106-01），入组患者均已签署知情同意书。

1.2 分组情况 将超重T2DM患者完全随机分为3组，每组30例，并给予3种治疗方案，具体如下：Met组给予单用二甲双胍治疗（格华止，中美上海施贵宝制药有限公司，批号：AAQ3622），每次剂量为0.5 g，3次/d，口服；Lira组给予单用利拉鲁肽治疗（利拉鲁肽，丹麦诺和诺德公司，批号：GP51912-1），每次晨起皮下注射利拉鲁肽，初始用量为0.6 mg/d，治疗1周后，增加用量至1.2 mg/d，再治疗1周后，增加用量至1.8 mg/d；Ct组给予二甲双胍和利拉鲁肽联合用药治疗。

Met、Lira、Ct 3组年龄依次为（49±10）岁、（48±9）岁、（47±9）岁，男/女例数依次为16/14例、15/15例、17/13例，病程依次为5（1，7）年、7（3，11）年、6（3，10）年。3组年龄（F=0.409，P=0.699）、性别组成（χ2=0.268，P=0.875）和病程（F=3.620，P=0.698）之间差异均无统计学意义。

1.3 方法

1.3.1 临床资料及生化指标 收集患者性别、年龄、身高、体质量、病程和治疗情况等资料。采用贝克曼库尔特AU5800系列全自动生化分析仪测定空腹血糖（fasting plasma glucose,FPG）、糖化血红蛋白（hemoglobin A1c,HbA1c）；采用ELISA试剂盒测定血清IL-6和TNF-α；采用放射免疫法测定空腹血清胰岛素（fasting serum lisulin,FINS），计算稳态模型胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）。

1.3.2 肠道菌群测定 收集患者治疗前及治疗12周后的粪便标本，采用16S rRNA高通量测序技术测定并分析患者肠道菌群变化特征；使用QIAamp DNA Stool mini Kit 强力DNA提取试剂盒（上海拜力生物科技有限公司），从患者粪便样品中提取细菌DNA；细菌16S rRNA基因的V3-V4区使用引物对（正向引物338F，5´-ACTCCTAGGGAGGAGCA-3´；反向引物 806R，5´-GGACTCHVGGGTWTTAT-3´）进行PCR扩增和测序，样品测序基于Illumina Hiseq 2500平台完成[10]。

1.3.3 生物信息学处理 使用FLASH软件对原始数据进行拼接、并通过Trimmomatic软件对所得序列进行质量过滤，使用UCHIME软件去除嵌合体得到高质量的标签序列。以序列相似度97%为标准进行聚类分析，以序列数的0.005%作为阈值，过滤操作分类单元（optical transform unit,OTU）。

1.4 统计学处理 基于R语言agricolae、phyloseq包进行统计分析。定量资料呈正态分布，用±s表示，病程用中位数（最小值，最大值）表示。3组性别分布比较用R×Cχ2检验，同一组治疗前后比较用自身配对t检验、3组间定量资料比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。使用ggpubr包中Kruskal-Wallis检验比较组间差异，并使用ggplot2包完成绘图；使用ggalluvial包绘制菌群丰度变化冲击图；基于ggcor包进行影响因子、菌群结构和菌群功能矩阵间相关性分析，绘制mantel检验组合图。通过PICRUSt软件对16S rRNA测序数据进行菌群功能与代谢通路预测。使用STAMP软件进行肠道菌群功能差异显著性分析及绘图[10]。

2 结 果

2.1 BMI及生化指标变化 12周治疗后，3组BMI分别为（31.48±1.21）kg/m2、（28.92±1.30）kg/m2、（28.29±1.22）kg/m2，均较治疗前有所降低（P均＜0.05）。3种治疗方案下，患者所有生化指标均较治疗前有所降低（P均＜0.05）。见表1～3。

表1 Met组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 1 Changes of BMI and biochemical indexes in Met group before and after treatment(±s)

表1 Met组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 1 Changes of BMI and biochemical indexes in Met group before and after treatment(±s)

指标 治疗前 治疗后 差值d t值 P值BMI(kg/m2) 31.90±1.17 31.48±1.21 1.30±0.96 7.231 0.000 FPG(mmol/L)10.87±1.38 7.93±0.54 2.99±1.46 11.013 0.000 HbA1c(%) 9.59±0.89 7.77±0.46 1.81±0.98 9.938 0.000 FINS(mmol/L) 20.45±7.20 13.06±2.68 9.25±5.18 9.605 0.000 HOMA-IR 7.53±4.25 4.55±1.22 4.39±3.13 7.547 0.000 IL-6(pg/ml) 49.84±7.07 29.11±3.37 20.72±8.04 13.872 0.000 TNF-α(ng/ml) 59.36±6.45 43.11±7.67 16.43±9.11 9.713 0.000 γ-GT(mmol/L)109.99±29.45 73.39±30.93 48.91±32.84 8.020 0.000 TG(mmol/L) 3.90±1.29 3.46±0.75 0.99±0.73 7.321 0.000 TC(mmol/L) 5.36±0.55 4.54±0.49 0.85±0.54 8.478 0.000

表2 Lira组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 2 Changes of BMI and biochemical indexes in Lira group before and after treatment(±s)

表2 Lira组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 2 Changes of BMI and biochemical indexes in Lira group before and after treatment(±s)

指标 治疗前 治疗后 差值d t值 P值BMI(kg/m2) 32.03±0.96 28.92±1.30 3.12±1.48 11.350 0.000 FPG(mmol/L) 10.50±1.54 7.74±0.84 2.81±1.35 11.236 0.000 HbA1c(%) 9.61±1.00 7.27±0.57 2.34±1.23 10.239 0.000 FINS(mmol/L)18.66±7.73 11.80±3.44 8.23±6.35 6.979 0.000 HOMA-IR 9.39±3.67 4.06±1.17 5.71±3.59 8.560 0.000 IL-6(pg/ml) 55.21±6.86 26.10±3.73 29.11±7.60 20.635 0.000 TNF-α(ng/ml) 60.72±7.71 37.07±7.69 23.65±9.44 13.496 0.000 γ-GT(mmol/L)102.53±30.32 65.24±26.12 46.35±29.25 8.532 0.000 TG(mmol/L) 4.24±1.14 2.52±0.85 1.94±1.04 10.040 0.000 TC(mmol/L) 5.72±0.59 4.34±0.42 1.39±0.75 9.972 0.000

表3 Ct组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 3 Changes of BMI and biochemical indexes in Ct group before and after treatment(±s)

表3 Ct组治疗前后BMI及生化指标变化（±s）Table 3 Changes of BMI and biochemical indexes in Ct group before and after treatment(±s)

指标 治疗前 治疗后 差值d t值 P值BMI(kg/m2) 32.14±1.20 28.29±1.22 3.85±1.60 12.937 0.000 FPG(mmol/L)10.70±1.23 7.31±0.68 3.40±1.35 13.593 0.000 HbA1c(%) 9.82±0.88 7.28±0.59 2.53±1.11 12.234 0.000 FINS(mmol/L) 16.77±6.83 12.64±3.26 6.52±6.02 5.834 0.000 HOMA-IR 9.68±3.95 4.50±1.18 5.99±3.40 9.494 0.000 IL-6(pg/ml) 53.30±6.54 21.94±3.48 31.36±7.58 22.265 0.000 TNF-α(ng/ml) 63.59±7.43 36.23±6.94 27.36±9.25 15.921 0.000 γ-GT(mmol/L)110.28±21.46 66.01±25.10 46.37±32.32 7.727 0.000 TG(mmol/L) 3.59±1.35 2.58±0.85 1.50±1.08 7.505 0.000 TC(mmol/L) 5.50±0.57 4.38±0.48 1.17±0.67 9.339 0.000

3种方案治疗后，Lira组和Ct组的BMI、IL-6、TNF-α、TG和TC的下降幅度均大于Met组（P均＜0.05）；Ct组的HbA1c下降幅度大于Met组（P＜0.05）。Lira组和Ct组指标下降幅度差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表4。

表4 3组BMI及生化指标变化的差值比较（±s）Table 4 Comparison of differences of BMI and biochemical indexes among 3 groups(±s)

表4 3组BMI及生化指标变化的差值比较（±s）Table 4 Comparison of differences of BMI and biochemical indexes among 3 groups(±s)

注：a.与Met组比较，P＜0.05

指标 Met组 Lira组 Ct组 F值 P值BMI(kg/m2) 1.30±0.96 3.12±1.48a 3.85±1.60a26.520 0.000 FPG(mmol/L) 2.99±1.46 2.81±1.35 3.40±1.35 1.363 0.261 HbA1c(%) 1.81±0.98 2.34±1.23 2.53±1.11a 3.239 0.044 FINS(mmol/L) 9.25±5.18 8.23±6.35 6.52±6.02 1.597 0.208 HOMA-IR 4.39±3.13 5.71±3.59 5.99±3.40 1.842 0.165 IL-6(pg/ml)20.72±8.04 29.11±7.60a 31.36±7.58a15.190 0.000 TNF-α(ng/ml)16.43±9.11 23.65±9.44a 27.36±9.25a10.430 0.000 γ-GT(mmol/L)48.91±32.84 46.35±29.25 46.37±32.32 0.063 0.939 TG(mmol/L) 0.99±0.73 1.94±1.04a 1.50±1.08a 7.027 0.001 TC(mmol/L) 0.85±0.54 1.39±0.75a 1.17±0.67a 4.955 0.009

2.2 各组肠道菌群多样性变化 治疗后，Met组和Ct组OTU数目和可观测物种数均显著上升（P均＜0.01），但Lira组变化为极显著降低（P＜0.001）。在菌群多样性方面，Met组和Ct组肠道菌群Shannon指数和Chao1指数均呈极显著上升趋势（P均＜0.001），而Lira组呈显著下降趋势（P均＜0.01）。见图1。

图1 3组治疗前后肠道菌群多样性变化A.3组治疗前后肠道菌群OTU数目的变化；B.3组治疗前后肠道菌群可观测物种数的变化；C.3组治疗前后肠道菌群Shannon指数的变化；D.3组治疗前后肠道菌群Chao1指数的变化；***.P＜0.001；**.P＜0.01Figure 1 Changes of intestinal flora diversity in 3 groups before and after treatment

2.3 肠道菌群LefSe分析 LefSe分析显示，3组患者治疗前后肠道菌群在分类水平（门至属）上呈现多重差异，Met、Lira、Ct组分别存在12、5、23个细菌类群丰度发生显著变化（P均＜0.05）。见图2。

图2 3组治疗前后肠道菌群LefSe分析A.Met组治疗前后患者肠道菌群显著性差异；B.Lira组治疗前后患者肠道菌群显著性差异；C.Ct组治疗前后患者肠道菌群显著性差异；LDA=4.0Figure 2 LefSe analysis of intestinal flora in 3 groups before and after treatment

2.4 肠道菌群结构变化 丰度变化结果显示，3组患者肠道菌群均以厚壁菌门（Firmicutes）为主（67.5%～74.7%）；其中Lira组治疗前肠道菌群中拟杆菌门（Bacteroidetes）丰度较低，但在用药治疗后丰度增加了约2.4倍。Met组和Ct组患者肠道菌群中肠杆菌目（Enterobacteriales）丰度较低；Lira组患者治疗后肠道Selenomonadales菌目丰度明显降低。Lira组患者肠道梭杆菌科（Fusobacteriaceae）丰度在治疗后大幅降低，而拟杆菌科（Bacteroidaceae）丰度大幅增加。在属一级，Lira组普氏菌属（Prevotella_9）的丰度在治疗后明显增加。见图3。

图3 3组治疗前后肠道菌群结构变化A.3组治疗前后肠道菌群变化（门水平）；B.3组治疗前后肠道菌群变化（目水平）；C.3组治疗前后肠道菌群变化（科水平）；D.3组治疗前后肠道菌群变化（属水平）Figure 3 Changes of intestinal flora structure in 3 groups before and after treatment

2.5 肠道菌群功能变化 功能预测结果显示，Lira组氨基酸代谢功能显著减弱（P＜0.01），Met组能量代谢功能极显著增强（P＜0.001），Ct组膜运输和信号转导功能均显著减弱（P均＜0.01）。同时，各组患者肠道菌群的碳水化合物代谢功能表达呈减弱趋势。脂质代谢功能整体变化趋势不明显，仅Met组出现明显降低趋势。见图4。

图4 3组治疗前后肠道菌群功能变化A.3组治疗前后肠道菌群氨基酸代谢功能基因丰度变化；B.3组治疗前后肠道菌群能量代谢功能基因丰度变化；C.3组治疗前后肠道菌群膜运输功能基因丰度变化；D.3组治疗前后肠道菌群信号转导功能基因丰度变化；E.3组治疗前后肠道菌群碳水化合物代谢功能基因丰度变化；F.3组治疗前后肠道菌群脂质代谢功能基因丰度变化Figure 4 Changes of intestinal flora function in 3 groups before and after treatment

2.6 肠道菌群相关性分析 基于目水平，对患者治疗前后重要生化指标、肠道菌群结构及功能（Class_2水平）进行矩阵相关性分析结果显示，肠道菌群内部相关性不明显，组间存在差异。Met组中双歧杆菌目（Bifidobacteriales）与FPG呈显著正相关；Lira组中肠杆菌目（Enterobacteriales）、Selenomonadales菌目与γ-GT呈显著正相关，拟杆菌目（Bacteroidales）与γ-GT呈显著负相关；而联合用药后，Ct组中并没有表现出明显的叠加效应，Selenomonadales菌目与FINS和γ-GT呈显著正相关，拟杆菌目（Bacteroidales）与FPG呈显著负相关，β-变形菌目（Betaproteobacteriales）与TC呈显著负相关，乳杆菌目（Lactobacillales）与FINS、TC呈显著负相关（P均＜0.05）。

所有患者菌群样本处理分析结果显示，患者FPG与乳杆菌目（Lactobacillales）呈负相关，与其他类群呈正相关但均不显著（P＞0.05）；FINS与乳杆菌目（Lactobacillales）、拟杆菌目（Bacteroidales）呈显著负相关；TC与丹毒丝菌目（Erysipelotrichales）及其他稀有菌群呈显著负相关；γ-GT与Selenomonadales菌目呈显著正相关（P均＜0.05）。

菌群结构与菌群功能表达相关性方面，红蝽菌目（Coriobacteriales）与膜运输、信号转导功能呈显著负相关；双歧杆菌目（Bifidobacteriales）与能量代谢和膜运输功能呈显著负相关；肠杆菌目（Enterobacteriales）与糖水化合物代谢、膜运输及信号转导功能呈显著正相关；拟杆菌目（Bacteroidales）与氨基酸代谢、能量代谢、膜运输和信号转导功能呈显著负相关（P均＜0.05）。见图5。

图5 肠道菌群相关性分析A.Met组临床指标与肠道菌群矩阵相关分析；B.Lira组临床指标与肠道菌群矩阵相关分析；C.Ct组临床指标与肠道菌群矩阵相关分析；D.所有患者肠道菌群与菌群功能相关分析；连线代表患者临床指标与肠道菌群存在相关性；相关性-1表示菌群内自相关关系；P值表示显著性（黄色连线代表显著相关，P＜0.05；灰色连线代表不显著相关，P＞0.05）；相关性-2表示生化指标与菌群相关关系；箱图中，蓝色箱为正相关，橙色箱为负相关，红叉为无显著相关性，P＞0.05Figure 5 Correlation analysis of intestinal flora

3 讨 论

人体肠道菌群在调节宿主能量平衡方面发挥着关键作用，其结构及功能变化与高血糖、胰岛素抵抗等病理过程密切相关。研究表明，失调的肠道菌群是多种代谢性疾病（包括超重、代谢综合征和T2DM）的重要影响因素[12]。二甲双胍与利拉鲁肽是当前临床用于治疗糖尿病合并肥胖的常用有效药物，目前上述2种药物对患者肠道菌群结构和功能具有重要影响。本研究拟通过高通量测序与生物信息学相结合的方法，比较二甲双胍与利拉鲁肽治疗后患者肠道菌群结构和功能的差异，为超重T2DM患者治疗方案的选择提供参考依据。

本研究中，肠道菌群主要以厚壁菌门（Firmicutes）为主（67.5%～74.7%），拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）为主要类群，上述结果与大多数研究结果一致[13-15]。既往文献表明，肠道菌群结构及功能的变化与超重T2DM等代谢性疾病的发生发展具有密切联系[16]，肠道菌群结构的失调如双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌丰度降低显著影响血糖变化[17-18]。

本研究发现，单用二甲双胍或联合用药均可显著增加肠道菌群物种多样性丰度，而单用利拉鲁肽产生的结果则完全相反，为极显著降低。此外，单用二甲双胍或联合用药对入组患者肠道微生物菌群结构影响显著，可分别干扰肠道12、23个细菌类群；而单用利拉鲁肽对肠道微生物菌群结构干扰较小，仅可对5个细菌类群产生显著影响，防止了肠道菌群出现紊乱。肠道菌群结构分析结果表明，利拉鲁肽针对作用于拟杆菌科、梭杆菌科、普氏菌属等，对其他细菌类群影响不显著。拟杆菌在帮助宿主分解多糖、肠黏膜血管再生及免疫系统发育等多方面具有重要作用，是维持肠道微生态均衡的“多面手”[19]。同时，利拉鲁肽治疗后，肠道普氏菌属（Prevotella_9）丰度同步增加，有助于患者在高纤维饮食后体质量的降低[20-21]。

此外，本研究通过分析3组患者BMI变化趋势发现，二甲双胍对患者BMI降低有影响，但是作用相对较弱；相比二甲双胍，联合用药对患者BMI的降低作用更为明显，但有可能进一步加剧肠道菌群结构的紊乱；而单用利拉鲁肽治疗对患者BMI降低效果与联合用药疗效相近，且仅影响少数肠道菌群，有助于肠道菌群整体稳定。因此，可以进一步推断，利拉鲁肽和二甲双胍2种药物对肠道菌群结构的影响机制可能不完全一致。

3种治疗方案下，患者所有生化指标均产生极显著变化。Lira组和Ct组的BMI、IL-6、TNF-α、TG、TC的下降幅度均显著大于Met组。以上结果说明单用利拉鲁肽或联合用药对2型糖尿病患者的疗效优于单用二甲双胍。TNF-α 是引起脂肪组织胰岛素抵抗的主要因素之一，近年来有研究发现在胰岛素抵抗患者的脂肪组织中存在着 TNF-α 的过度表达[22]。IL-6可由脂肪细胞等分泌，影响机体的糖脂代谢。并且随患者 IL-6表达增加，胰岛素敏感性降低[23]。本研究中，Lira组治疗后 HOMA-IR和IL-6等炎性介质指标均极显著降低，这证实了利拉鲁肽可以通过减轻炎症反应来改善胰岛素抵抗。此外，Lira组和Ct组指标下降幅度差异均无统计学意义。以上结果说明利拉鲁肽在患者生化指标变化中发挥了主要作用，临床治疗效果优于二甲双胍。此外，菌群功能预测结果表明，肠道菌群功能与生化指标存在一定关联性，Met组中双歧杆菌目（Bifidobacteriales）可能通过影响膜运输和调节能量代谢而降低FPG；Lira组肠道菌群变化与γ-GT保持显著相关关系，表明利拉鲁肽优先通过调节激素以及酶系统达到治疗效果；Ct组结果显示诸多细菌类群丰度变化同时与FPG等诸多生化指标保持显著的相关关系。药物通过调节多种代谢途径、膜运输以及信号转导等途径从而影响宿主的代谢过程。

本研究患者均来自于西北地区且样本量偏小，而且基于菌群功能预测研究也难以完整揭示菌群代谢通路改变与机体代谢的内在联系，须要开展更多的深入研究进行明确。

综上所述，本文通过对3种用药方案下超重T2DM患者治疗前后肠道菌群结构与功能变化的研究，发现二甲双胍与利拉鲁肽对肠道菌群结构和功能都有影响。其中，利拉鲁肽对患者肠道菌群干扰较小，二甲双胍与利拉鲁肽联合治疗对患者肠道菌群结构干扰较大，建议未来在治疗方案选择上应适当考虑药物对肠道菌群结构影响。