氧化应激和线粒体质量控制与牙周炎关系的研究进展

丁旭 李鑫 李艳 夏博园 于维先

1.吉林大学口腔医院牙周科 长春 130021；2.吉林大学口腔医院老年口腔科 长春 130021；3.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室 长春 130021

牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性炎症性疾病，引起牙周组织破坏主要是由于细菌及其代谢产物所产生的炎症介质造成机体免疫功能失衡的结果[1]。多形核中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）等防御细胞对细菌及其代谢物如脂多糖（lipopolysaccharide，LPS） 的反应所释放的活性氧（reactive oxygen species，ROS）会加重牙周组织损伤[1-2]。线粒体是ROS的主要来源[3]。Govindaraj等[4]的研究表明：牙周炎患者的线粒体功能存在异常。牙周炎患者成纤维细胞的凋亡表现出明显的线粒体破碎、畸形等[5]。Sun等[6]发现：线粒体氧化应激在糖尿病加重牙周炎中起重要作用。由这些研究可以推测，线粒体质量控制可能在牙周炎的发生发展中起到关键作用。线粒体质量控制过程包括线粒体的生物发生、动力学和自噬三大部分[7]，本文分别进行论述，旨在为牙周炎的防治提供新途径。

1 线粒体的生物发生

线粒体生物发生是指线粒体通过生长和分化产生新的线粒体，以维持线粒体的数量和生理功能。病理情况下，线粒体的生物发生处于失衡状态[8-9]。线粒体的独特性在于它是一个半自主的细胞器，拥有自己的基因组[5,9-11]，即线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）。在氧化应激条件下，mtDNA更容易受到ROS的攻击[12]，从而导致线粒体功能失调。线粒体的生物发生依赖于转录因子和共激活因子之间的相互作用，如过氧化物酶体增殖物激活受体-γ共激活因子1 α（peroxisome-proliferator-activated receptor-gamma co-activator 1α，PGC-1α）、核呼吸因子1/2（nuclear respiratory factor 1/2，Nrf1/2）、线粒体转录因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）等[11]。

1.1 PGC-1α与牙周炎的关系

PGC-1α是线粒体生物发生的主要调节因子[13]，属于转录共激活因子[8,11]，主要位于细胞质内[14]。研究[14-15]表明：PGC-1α位于线粒体室中，在线粒体D环与TFAM相互作用，共同调控线粒体生物发生过程。PGC-1α磷酸化后，定植于细胞核中，上调生物发生[14]。PGC-1α还可以通过调节转录活性，诱导Nrf1、Nrf2和TFAM的基因表达，从而协调核DNA和mtDNA编码的线粒体蛋白的基因表达[15]。Singh等[16]研究证实：牙龈卟啉单胞菌通过降低PGC-1α而增加脂肪细胞的炎症水平和氧化应激，从而确定牙周炎与肥胖之间关联的潜在机制。蔡川等[17]发现：炎症刺激下，牙周膜干细胞（periodontal ligament cells，PDLSCs） 的PGC-1α/β、有丝分裂蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、线粒体内膜转运酶13 （translocase of inner mitochondrial membrane 13，TIMM13）表达均下调，表明细胞线粒体生物合成功能受到了影响。Hong等[18]证实：牙龈间充 质干 细胞 （gingival mesenchymal stem cells，GMSCs）可通过增加PGC-1α的表达，改善牙周组织炎症，促进牙周组织的骨再生。

1.2 Nrf2与牙周炎的关系

Nrf2属于碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper，BZIP）转录因子家族，与线粒体生物发生过程密切相关。Nrf2通过与Nrf1的4个抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）启动子序列结合而正调控Nrf1，从而介导TFAM线粒体生物发生途径的激活[19]。同时，Nrf2调控抗氧化酶的表达，从而保护机体免受氧化应激的伤害[20]。在牙龈卟啉单胞菌LPS刺激巨噬细胞产生的炎症反应中，Nrf2的表达降低[21]。在牙周炎的发病机制中，PMNs和巨噬细胞的免疫防御作用起了关键作用。健康状态下，PMNs等防御细胞会对ROS等刺激作出反应，引发机体防御反应；而在疾病状态下，PMNs会衍生过量的ROS，加剧牙周组织的炎症反应[22]。Sima等[22]研究发现：重症牙周炎患者的PMNs 中Nrf2 通路下调。因此，Nrf2 可能是PMNs的一个重要调节因子，抑制PMNs对牙周致病生物膜的反应[23]。在碱性条件下，Nrf2受到泛素蛋白酶系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）的严格调控，从而使Nrf2蛋白保持在低水平，防止不必要的抗氧化基因的转录[23]。Kelch样ECH相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）是一种衔接蛋白，它与Nrf2结合并促进其降解[24]。在氧化应激条件下，Nrf2从Keap1中释放出来，进入细胞核，与小的MAF（具有亮氨酸拉链结构域的蛋白质）形成异源二聚体识别靶基因的转录[25]。Kataoka等[26]在Keap1荧光素酶报告小鼠中发现：在实验性牙周炎模型中Nrf2移位到细胞核，Nrf2核定位增加。黄芩素（baicalein，BCI）通过增加Nrf2及其下游基因（cat、gclc、sod1和sod2）的表达，减轻牙周炎合并糖尿病患者的组织损伤[27]。此外，Kanzaki等[28]发现：Nrf2的激活剂萝卜硫素和表没食子儿茶素没食子酸酯能够抑制破骨细胞的生成，含有细胞通透性序列的ETGE肽（seven consecutive arginine，7R-ETGE）通过诱导Nrf2核转位减少破骨细胞生成。与野生型细胞相比，Nrf2缺陷的破骨细胞前体细胞中的破骨细胞分化和骨吸收显著增强[29]。沉默Nrf2可增加PDLSCs的TUNEL（细胞凋亡检测方法）阳性细胞数量以及caspase-9和caspase-3的活性，上调促凋亡蛋白Bax的表达并下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达[30]。白藜芦醇是Nrf2的有效激活剂，通过激活Nrf2/血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）介导的信号通路减轻炎症反应，同时可以改善牙周炎大鼠的牙槽骨丧失[2]。

1.3 TFAM与牙周炎的关系

TFAM主要通过与mtDNA特异性结合来调控线粒体转录[5,7,11]。在适当的刺激下（如运动刺激），PGC-1α能激活TFAM，使其导入线粒体DNA，上调编码电子传递链亚单位基因的表达，使耗氧量增加，三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成增加，线粒体含量增加[7]。在tfam基因敲除的小鼠模型中，表现出线粒体肥大，嵴异常和呼吸链功能障碍[31]。在另一个基因敲除小鼠模型中，多巴胺神经元中的tfam基因敲除导致mtDNA表达减少[32]。Miyazaki等[33]发现：tfam基因消融小鼠表现出破骨细胞骨吸收功能明显增强，破骨细胞的线粒体出现线粒体嵴的紊乱，提示线粒体功能出现障碍。有研究[34]显示：成纤维细胞经牙龈假单胞菌LPS处理后，PGC-1α和TFAM蛋白的表达水平均降低，证实牙龈假单胞菌LPS对线粒体生物发生具有下调作用。然而，目前关于TFAM与牙周炎之间明确关系的相关研究仍较少。

2 线粒体动力学

线粒体动力学是指线粒体经过不断的融合和裂变事件[4-5,9,13,35]来维持其形态及生理功能。融合过程有助于使受损线粒体含量均匀化，使线粒体寿命延长。裂变导致线粒体断裂，并通过选择性自噬的方式促进受损线粒体清除[9]。目前，线粒体分裂和融合机制中的几个关键元件已被确定，即有丝分裂蛋白（mitofusin，Mfn）1、Mfn2、视神经萎缩蛋白1（optic atrophy 1，OPA1）和动力蛋白相关蛋白1（dynamin related protein 1，Drp-1）[13,36]。

2.1 线粒体融合相关蛋白

线粒体是由双层膜结构所组成的细胞器，在线粒体外膜（outer mitochondria membrane，OMM）和内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）上分别存在着与线粒体融合过程相关的蛋白质。位于OMM上的Mfn1、Mfn2和位于IMM上的OPA1在线粒体融合过程中起关键作用[9,13,36]。OPA1在蛋白水解裂解位点的组成过程产生2种OPA1亚型，即long-OPA1（L-OPA1）和short-OPA1（S-OPA1），它们共同调节线粒体融合状态[9]。L-OPA1形式的表达促进了线粒体融合，S-OPA1形式的表达则促进了线粒体的断裂[35]。作为应对应激的反应，L-OPA1被蛋白水解成S-OPA1，从而诱导线粒体断裂和凋亡[35]。Chen等[5]的研究结果表明：过氧化氢能显著降低人PDLSCs中Mfn1和Mfn2的表达，同时促进L-OPA1向S-OPA1的快速裂解。这些研究提示：在氧化应激诱导的人PDLSCs凋亡过程中，线粒体功能和动力学均明显受损[5]。Drp1、Mfn2不仅定位于线粒体，也定位于内质网。Sharma等[37]阐述了线粒体融合机制：线粒体融合开始于2个分离的线粒体通过外膜拴系Mfn1和Mfn 2，与OMM融合后再由OPA1蛋白介导线粒体IMM融合，从而导致2个独立的线粒体融合。翟启明等[38]的研究显示：与健康组相比，炎症刺激下PDLSCs中内质网线粒体偶联水平显著增加，Mfn2蛋白的表达量增高，成骨能力显著下降，说明炎症状态下的PDLSCs的成骨分化能力下降与内质网-线粒体偶联增强相关，通过下调Mfn2水平，其成骨能力得以恢复。翟启明等[39]在另外一项研究中发现：炎症微环境下，PDLSCs中Mfn1的表达量升高，导致细胞的成骨分化能力下降。该结果与上文氧化应激状态下PDLSCs中Mfn1和Mfn2表达降低相悖，仍需进一步研究。

2.2 线粒体分裂相关蛋白

线粒体的分裂主要由Drp1介导[9,37]。Drp1主要定位于细胞质中，介导膜的收缩和断裂[40]。Sharma等[37]阐述了线粒体分裂机制：线粒体分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）、线粒体分裂1蛋白（mitochondrial fission 1 protein，Fis1）、线粒体动力学蛋白49（mitochondrial dynamics protein-49，MiD49）和线粒体动力学蛋白51（mitochondrial dynamics protein-51，MiD51）等受体蛋白招募Drp1至线粒体，Drp1在OMM上形成多聚体，进而形成螺旋，水解三磷酸鸟苷（guanosine triphosphate，GTP），导致线粒体收缩。线粒体在裂变（分裂）和融合之间不断经历形态变化，以响应各种代谢和环境变化。如果融合和分裂之间的平衡被打破，线粒体分裂会促进细胞凋亡，抑制Drp1活性[41]。Gan等[42]的研究表明：Drp1参与了氧化应激诱导的线粒体功能障碍，导致成骨细胞损伤。Chen等[5]发现：用过氧化氢处理PDLSCs显著增加了Fis1和Drp1的表达，进一步支持线粒体分裂与PDLSCs凋亡密切相关的结论。He等[43]通过建立PDLSCs 缺氧模型发现：Drp1 表达显著增高而Mfn2表达显著降低；而通过线粒体分裂抑制剂1（mitochondrial division inhibitor 1，Mdivi-1）治疗，可逆转缺氧状态下的线粒体碎裂，改善线粒体功能。这些研究表明，不仅是ROS，缺氧状态也会加重牙周组织损伤，但缺氧对牙周组织的影响还处于初步探索阶段。

3 线粒体自噬

线粒体自噬是一种选择性自噬，通过形成自噬体降解受损的线粒体[9,11]，其中最著名的便是由PTEN诱导的假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，Pink1）和E3泛素-蛋白连接酶（E3 ubiquitin-protein ligase，Parkin）介导的线粒体自噬[7]。Pink1在细胞核内编码并在细胞质中合成[44]。有学者[45]提出Pink1主要定位于线粒体OMM。正常情况下，细胞内的Pink1表达水平很低，几乎检测不到。内源性的Pink1只有在一定的应激条件下才有可能被检测到[44,46]。Pink1在线粒体内的积累主要与线粒体损伤和缺陷有关，表现为线粒体膜电位的丧失。膜电位丧失阻止了Pink1从OMM到达IMM，无法被相关蛋白酶降解，使全长的Pink1在OMM积聚[44,46]。Okatsu等[46]研究表明：在解偶联毒素（carbonyl cyanide-chlorophenylhydrazone，CCCP） 的 诱导下，与外源表达的Pink1相比，内源性全长Pink1的条带略有上移。该研究进一步证明，在功能障碍的线粒体中，全长的Pink1在OMM积聚。Pink1在OMM积聚后，会招募Parkin以泛素化受损的线粒体[44,46]。Parkin用Pink1产生的磷酸泛素标记嵌入OMM的蛋白质，然后成为Pink1的底物，反馈放大自噬信号[9]。正常情况下，通过线粒体自噬可以清除受损的线粒体；但过量自噬可能会促进细胞凋亡和组织损伤[47]。Yang等[47]发现：成骨细胞经缺氧处理后，Pink1/Parkin在线粒体上迅速积聚并促进成骨细胞凋亡；通过沉默Pink1则可显著抑制成骨细胞凋亡。Chiricosta等[48]也发现，用Moringin（一种抗氧化剂）预处理PDLSCs后，Pink1的表达下调并调控相关凋亡基因的表达，从而抑制了细胞凋亡。Parkin还通过泛素化OMM上直接或间接参与线粒体自噬的许多蛋白质，包括Mfn1/Mfn2、PGC-1α等，显著增强线粒体自噬[9]。目前有关Pink1与慢性牙周炎之间的研究仍处于初级阶段，需要进一步探索。

综上所述，线粒体质量控制是一个十分复杂、庞大的系统，各级信号通路之间存在串扰。氧化应激可能是牙周炎发生发展的促进因素，而线粒体是ROS的直接靶点，会进一步加重组织损伤。本文从线粒体质量控制的三阶段阐述其与牙周炎间的关系，旨在为牙周炎的防治提供新的方向。

利益冲突声明：作者声明本文无利益冲突。