中药干预自噬治疗缺血性脑卒中作用机制研究概述

张雪玉 蔡恩丽 褚 鑫 藏 瑞 李旭华 武煜明

云南中医药大学，云南 昆明 650000

脑卒中又称脑中风或脑血管意外，是全球首要致死和致残病因。该病有出血性和缺血性之分，其中缺血性脑卒中约占比85%[1]。临床一般采用经静脉重组组织纤溶酶原激活物 (rt-PA)溶栓治疗或血管内介入诊疗，有效的治疗药物还没有获得临床证实，依然处于空白状态。自噬是当细胞面临低氧、炎症、营养限制等应激环境时，能根据胞内不同环境和压力下细胞器的数量及完整性，降解异常蛋白和受损细胞器去除不利于细胞存活的因素，并将降解所产生的物质循环利用于细胞更新修复的一种生存机制。中药通过多条信号转导通路干预自噬并揭示了脑缺血损伤后细胞内损伤及修复的机制，目前研究最多的是哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)及凋亡等通路。本文就传统中药干预自噬防治缺血性脑卒中的主要作用机制，进行如下概述。

1 中药干预自噬对缺血性脑卒中的主要治疗作用

1.1 减轻血脑屏障破坏 血管再通是缺血脑组织生存所必需的，但氧合血液突然流入缺血脑组织可能会破坏已经受损的血管内皮，加剧血脑屏障的破坏和通透性，过量液体和血浆蛋白外渗并停聚于周围脑细胞间隙，引起血管源性脑水肿和血细胞外渗。研究证实，适度自噬可减轻缺血再灌注(CIR)引起的血脑屏障破坏。陶红苗等[2]发现，CIR组神经元损伤较重，自噬泡增多，而缺血后适应组的适应性调控可对自噬产生抑制作用，有效缓解神经元损伤程度。三化汤具有宣行气血、通腑开结的作用，可抑制血管源性水肿，促进神功能恢复，使血脑屏障免受缺血再灌注损伤[3-4]。藁本内酯是当归挥发油的有效成分，通过干扰细胞内钙离子代谢，抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，减轻神经功能损伤程度，改善脑水肿及血管通透性[5]。

1.2 减轻氧化应激 当脑缺血及缺血再灌注时，骤然恢复血流和供氧导致代谢紊乱及兴奋性中毒，活性氧(ROS)的产生与细胞抗氧化剂防御的内源性清除能力失衡造成氧化应激(OS)反应，能促使神经元功能丧失。研究证实，中药干预自噬途径可以改善OS，减少细胞毒性物质的生成，降低脑组织损伤。朱丽娟等[6]在体外拟CIR模型，发现当归挥发油可以提高抗氧化能力，促进自由基的清除，使细胞死亡率显著降低。红花注射液具有抗氧化活性，可以降低缺血脑组织血清中丙二醛(MDA)及提高超氧化物歧化酶(SOD)活性，有效清除自由基进而达到抗氧化的作用[7]。复方制剂丹红注射液对脑缺血缺氧损伤具有一定的保护作用，其保护作用可能与抑制胞内ROS水平及脂质过氧化反应，降低缺氧对细胞膜的损伤[8]。

1.3 减轻炎症反应 OS发生后，ROS还会通过神经元，内皮细胞触发基质金属蛋白酶(MMPs)和其他蛋白酶的释放，进而侵蚀内皮基底层，浸润性白细胞又释放多种促炎介质，损伤血脑屏障，引发神经炎症反应。炎症与自噬在缺血性脑损伤中相互影响，调节炎症因子的表达水平，可以降低自噬性死亡。实验发现，丹参酮ⅡA可以下调TNF-α和白细胞介素-6( IL-6) 等促炎症细胞因子的表达，提示丹参酮ⅡA预处理可通过抑制炎症减轻CIR损伤[9]。补阳还五汤通过下调患者血清中的IL-6、TNF-α等炎症因子水平，抑制参与炎症反应的 MMP-2及 MMP-8水平，减轻缺血损伤[10-11]。抑制大鼠脑组织的内皮素-1(ET-1)高度表达引起的局部炎症反应可能是镇肝熄风汤发挥对脑梗死的防治作用的主要分子机制[12]。三化汤通过减少缺血脑组织中的 IL-1β，ICAM-1的表达，减少白细胞浸润数量，减缓炎症反应，保护神经元细胞[3-4]。阿魏酸是当归挥发油中的有效成分，其发挥脑保护作用可能与抑制NF-κB的活化，下调TNF-α，IL-6等促炎症因子的表达，抑制炎症反应有关[13]。

2 中药干预自噬治疗缺血性脑卒中的主要作用机制

2.1 干预mTOR 信号介导的自噬 在缺血、缺氧等应激条件下自噬可被激活，这主要与mTOR调控有关，mTOR包含m TORC1和mTORC2两种复合体，其中m TORC1含特殊的mTOR调控相关蛋白，是主要调节靶点，起负向调控自噬的作用。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的催化结构域包含磷酸化位点，可调节mTOR 的活性。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)是 mTORC1和mTORC2 相互作用的连接点。张怡[14]证实黄芪甲苷通过介导 AMPK/DDiT4/mTOR 信号通路激活自噬抑制CIR损伤。汪光云[15]建立CIR模型，加入PI3K的抑制剂后发现，通窍活血汤能够激活 PI3K/AKt/mTOR通路，抑制脑缺血损伤后的细胞自噬，继而发挥神经保护的作用。李丹丹[16]发现，人参皂苷Rg1可能通过诱导大脑局灶性CIR模型自噬相关蛋白Beclin-1、LC3和mTOR的表达水平，激活自噬诱导神经元存活。沈浩[17]发现犀角地黄汤能促进Akt/mTOR信号通路，抑制细胞外信号调节激酶(ERK)磷酸化，减少LC3-I向LC3-II的转化及P62蛋白降解，下调半暗带皮层组织的自噬水平，发挥缺血后脑组织保护作用。

2.2 干预MAPK信号介导的自噬 MAPK由P38激酶(p38 MAPK)，ERK，c-Jun氨基末端激酶(JNK) 构成。MAPK信号通路介导了缺血性脑卒中自噬的分子过程，JNK和p38 MAPK正向调节自噬，ERK反之。p38 MAPK信号通路适度活化能促进神经元抗炎、抗凋亡等作用，提高神经元存活率。反之，过度诱导则会促进靶基因表达激活转录因子和胱冬蛋白酶等，加速神经元损伤。Wang[18]等发现，黄连解毒汤组抑制mTOR的活化，从而诱导自噬与调节MAPK信号通路有关，通过激活ERK、抑制 JNK和p38 MAPK信号介导保护性自噬。贾冬雪[19]发现荭草苷对大鼠脑缺血再灌注损伤保护作用机制与荭草苷调控JNK/ERK通路，抑制自噬水平相关。预给药脑缺血大鼠补阳还五汤后，Akt 蛋白和 p38 MAPK蛋白磷酸化水平明显降低，其机制可能与激活MAPK/ERK信号通路，促进神经元细胞再生有关[10-11]。

2.3 干预自噬效应蛋白 自噬过程需要自噬相关基因(Atg)的参与，其中自噬特征蛋白 Beclin-1和自噬体膜上标志蛋白微管相关蛋白轻链3(LC3)及自噬底物募集蛋白P62是参与自噬的三个关键蛋白。黄亚光[20]发现竹节参总皂苷能改善脑缺血再灌注后大鼠的神经功能，显著减小脑梗死体积，且通过电镜发现自噬小体减少，同时Western Blot检测发现竹节参总皂苷抑制LC3Ⅱ和提高P62的表达，推测竹节参总皂苷可能通过抑制自噬的过度激活，从而缓解脑缺血再灌注损伤的发展。Zheng等[21]发现银杏总内酯可以抑制缺血再灌注引起的Bec-lin-1表达上调。另外，兰新新等[22]在脑缺血再灌注损伤治疗作用的基础上，发现银杏总内酯抑制大鼠缺血复灌24、72 h的LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化，诱导自噬底物 P62表达，推测银杏总内酯通过抑制缺血引起的自噬水平过度升高，发挥神经保护作用。

2.4 干预凋亡相关蛋白 一些凋亡相关蛋白可通过调节自噬治疗卒中，如半胱氨酸蛋白酶(Caspase)，B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2) 家族基因，Bcl-2 家族包括抑凋亡蛋白 Bcl-2 和促凋亡蛋白 Bax。Caspase 是执行细胞凋亡程序并调节炎症介质的一种半胱氨酸蛋白酶，尤以caspase-3在缺血介导的神经细胞凋亡早期最为关键。caspase和Bcl-2可以裂解自噬相关蛋白，抑制凋亡能加速自噬的启动。邹玲[23]发现龙蛭汤组脑组织中Bcl-2蛋白阳性细胞率均明显升高，Caspase-3阳性细胞则明显减少，推测龙蛭汤能减轻CIR大鼠神经元损伤可能与调控Bcl-2和Caspase-3的表达有关。还发现菟丝子黄酮[24]、银杏内酯[25]、川芎嗪[26]及血府逐瘀汤[27]对脑缺血大鼠都具有神经保护作用，一定程度上可减少大鼠神经细胞凋亡，主要与抑制Bax /Bcl-2和Caspase-3凋亡途径有关。

3 总结与展望

综上所述，应用中药干预自噬治疗脑缺血在大量动物实验研究中已证实。中药类单体和复方主要通过调控mTOR、MAPK及凋亡等信号转导通路干预自噬，并对脑缺血后脑保护(梗死面积与神经功能评分及血脑屏障完整性)，抗氧化及炎症等并发症，阻断血管再通引发的级联反应方面具有显著神经保护作用。近期人们把研究目光聚焦于溶栓疗法与中药神经保护制剂联用对抗缺血后脑组织神经保护研究方面，并发现预后优于单用rt-PA，对缓解溶栓后缺血再灌注损伤具有一定的启示作用。另一方面由于中药成分复杂，作用靶点难以明确，如何在保留中医整体观念前提下，寻找中药治疗脑缺血主要作用及干预机制，值得进一步探索。本课题组下一步将从体内和体外两个角度对中药干预缺血性脑卒中自噬的具体机制进行深入研究。