液相色谱-串联质谱技术在中药体内过程研究中的应用

杨崇仪 吴 凡 程 宾 王 莉 张红宇

云南省食品药品监督检验研究院，云南 昆明 650011

中药制剂是以中医药理论为指导，以中药为原料，按规定的处方和方法加工成的一定剂型，是中医传统理论与西医的结合的产物。在加速中药现代化以后，中药注射剂被大量运用于临床治疗，由于中药制剂成分复杂、多变，加之近年来中药制剂在临床使用中的不良反应频发，中药制剂的有效成分分析尤其是体内过程分析成为了急需解决的问题，也成为了研究的热点。随着中药的药代动力学、中药代谢组学、中药配伍机制等研究的不断深入，中药制剂的体内过程分析成为不可或缺的手段。中药制剂本身就是一个非常复杂的体系，而进入体内经代谢或发生复杂的相互作用后，其组成会更加复杂，而且这些成分在体内含量一般很低。如何在这样复杂的体系中对中药制剂体内成分进行准确的分析，成为中药能否深入研究的关键。液相色谱-串联质谱法选择性强、灵敏度高、分离能力好，不仅能对化合物准确定量，还能提供化合物大量的结构信息，尤其适合于复杂体系的成分分析[1]，近年在中药制剂分析领域迅速广泛应用[2]。

1 液相色谱

色谱的原理是利用待测组分在固定相和流动相的分配系数不同从而达到将不同的待测组分分离开来的效果。最常用的液相色谱法是用液体作为流动相的柱色谱法。高效液相色谱法便是基于传统的液相色谱法而优化后得到的方法。

液相色谱的应用主要分为两大类。一类是对某个具体待测物进行定性和定量检测，定性检测主要根据待测物与对照品的保留时间来进行对照定性。定量测定是通过利用不同浓度的对照品溶液绘制出标准曲线，利用标准曲线的公式来对待测样品进行定量[3]。第二类是指纹图谱，指纹图谱是指某些复杂物质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图，指纹图谱在中药的分析中占有重要的位置[4-5]。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。

2 串联质谱

串联质谱法是指将两个及两个以上的质谱结合在一起进行分析工作。目前应用较多的串联质谱是指三重四级杆质谱(QQQ-MS)，第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2, 第二级四极杆分析器的作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击,将母离子打碎，碎片离子进入MS2再进行分析。其他类型的串联质谱还有四级杆-飞行时间质谱(Q-TOF-MS)、四级杆-离子阱质谱(Q-IT-MS)以及其他不同串联方式的串联质谱。

虽然串联质谱可以对化合物进行精确的定量和提供有效的结构信息，但是对于样品的纯净度有较高的要求，尤其对于组份多而复杂的中药，在进入质谱前必须对待测组份进行分离纯化，所以液相色谱-质谱联用技术是中药体内过程分析的有力手段。

3 液相色谱-串联质谱法

液相色谱-质谱法将应用范围极广的分离方法与灵敏、专属、能提供相对分子质量和结构信息的质谱法结合起来, 因此已成为一种重要的现代分离分析技术。虽然与液相色谱系统相连的单极质谱仪也能够提供相对分子质量的信息, 但不足之处在于基质对待测组分的干扰难以排除及待测组分的结构信息不能充分利用，容易出现假阳性的结果。液相色谱与串联质谱联用可在一级质谱MS条件下获得很强的待测组分的准分子离子峰, 几乎不产生碎片离子, 并将需要的准分子离子进入下一级质谱进行多级裂解, 进而获得丰富的离子对信息, 可用来推断化合物结构, 确认目标化合物, 辨认重叠色谱峰以及在高背景或干扰物存在的情况下对目标化合物定量, 因而成为药物体内过程研究中更为常用、更为准确的工具。根据不同的质量分析器的串联方式，液相色谱-串联质谱法可分为以下常见的几种：

3.1 液相色谱-三重四级杆串联质谱(LC-QQQ-MS) 三重四级杆顾名思义是由三个四级杆分析器按照一定的空间顺序串联而成，每一个四级杆都有其自己独立的功能。由于中药成分复杂，结构相似，有的成分结构甚至是同分异构体。但有了三重四级杆串联质谱提供的离子对信息，可以跟准确的对被分析组份进行定性，避免了假阳性的产生。检索近10年来运用液相色谱-串联质谱法对中药体内过程进行研究的文献，发现研究的中药涵盖了植物源中药、动物源中药、中药注射液、中成药胶囊和传统中药汤剂等。所进行的体内过程研究的生物载体，主要为人类志愿者、比格犬、大鼠和羊，被测组分所在的生物介质多数为血浆、尿液和器官组织。

Qian等[6]用LC-QQQ-MS对《伤寒论》中的传统方剂“四逆汤”进行了主要成分的定性分析并且对其在SD大鼠体内的代谢产物进行分析，鉴定出了“四逆汤”的83中化学组分，涵盖了生物碱、黄酮、皂苷、胆酸、三萜类化合物，研究显示这些化合物在大鼠体内共有39种代谢途径，有多达50种代谢产物。Zhao等[7]给大鼠灌胃清肝散结汤后，利用LC-QQQ-MS建立测定大鼠血浆中齐墩果酸熊果酸的含量，并且进行药代动力学研究。唐悦年等[8]研究灌胃射干合剂后大鼠体内的盐酸麻黄碱药动学，发现盐酸麻黄碱在吸收后24 h内基本从尿液里回收，而在粪便中不能测得，说明盐酸伪麻黄碱在大鼠体内不经过肝胆循环。杨荣等[9]运用LC-QQQ-MS对中药名方活血化瘀方中的丹参素在大鼠体内组织分布进行研究，结果显示：除了主要排泄器官肾脏以外，丹参素含量最高的器官组织为肾脏，其次为脑和肝脏，说明丹参素能较好通过血脑屏障，肝脏浓度较高也证实丹参归心、肝经的中医理论。Jin等[10]运用LC-QQQ-MS对中药经典方剂大黄硝石汤种的13种活性成分进行定性分析，阐述大黄硝石汤中的活性成分与其治疗黄疸的药效关系。Ma等[11]运用LC-QQQ-MS对“海藻玉壶汤”和海藻甘草合剂中的甘草黄苷、柚皮苷、橙皮素、甘草素、甘草酸、佛手柑内酯、蜜桔黄素、蛇床子素及甘草次酸在甲状腺减退小鼠模型的药代动力学研究，显示海藻玉壶汤和甘草合剂中的主要成分如蜜桔黄素和蛇床子素的药代动力学参数要优于甘草或者海藻单独组分使用的药代动力学参数，提示海藻玉壶汤和甘草合剂的配方组成具有很好的相容性。姜丽等[12]对《伤寒论》中的经典药方大承气汤中的3类共10种有效成分进行研究，建立应用LC-QQQ-MS对该10种成分进行快速准确分析的方法并成功应用于药代动力学研究，发现其中的橙皮苷，新橙皮苷和柚皮苷药时曲线呈双峰，提示该三种物质在大鼠体内存在肝肠循环的可能。

Wu等[13]应用正负离子同时检测的方法对比格犬口服血塞通软胶囊后，血浆中的三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re和原人参三醇进行测定。Li等[14]在对黄芩素咀嚼片的一期临床试验研究中，也运用LC-QQQ-MS对黄芩素在志愿者体内的药代动力学进行分析。潘艳娜等[15]首次利用LC-QQQ-MS建立对大鼠血浆中阿魏酸的浓度的测定方法，并且应用于研究谷维素与黄连素及其配伍在大鼠中药动学的比较分析，试验结果表明谷维素与黄连素合用后，谷维素有效代谢产物阿魏酸的达峰时间明显延长且AUC0-∞变大，同时黄连素的消除半衰期变短但是AUC0-∞变大，说明谷维素对黄连素的吸收有促进作用。李武超等[16]运用LC-QQQ-MS，对大鼠静脉注射斑蝥素后，测定斑蝥素在大鼠体内各器官的分布，显示斑蝥素在肝肾组织中浓度较其他器官组织高，并且呈计量依赖性，提示斑蝥素的肾毒性可能与其在肾脏分布较高有关，为临床安全用药提供参考依据。

Li等[17]利用LC-QQQ-MS测定中药独活中的没药当归烯酮在大鼠体内的生物利用度及组织器官分布，并发现没药当归烯酮可以通过血脑屏障，佐证独活具有抗阿尔茨海默病的功效。Zhang等[18]应用LC-QQQ-MS建立测定传统中药野马追中的野马追内酯A、野马追内酯B和金丝桃苷在大鼠血浆中的浓度测定方法，并且对大鼠灌胃野马追提取物后的药代动力学进行研究，发现三种成分在大鼠体内的药动学参数呈剂量相关性，并且提示三种成分在大鼠体内存在被动扩散吸收的可能。Liu等[19]建立应用LC-QQQ-MS对传统中药两指剑中的两个有效成分野漆树苷和女贞苷进行测定的方法、并首次对其在大鼠体内的药代动力学参数进行测定。Yang等[20]利用LC-QQQ-MS对传统中药苦参中的两个有效成分槐黄烷酮G和苦参酮在大鼠体内的药代动力学参数进行测定，计算得出给大鼠灌胃一定剂量的苦参提取物后，黄烷酮G的绝对生物利用度为36%，苦参酮的绝对生物利用度为17%，并且槐黄烷酮G的药-时曲线呈双峰状，提示槐黄烷酮G在大鼠体内可能存在胃肠循环。黄勇等[21]利用LC-QQQ-MS研究荭草提取物中4个黄酮类成分的大鼠组织分布，结果显示：大鼠静脉注射荭草提取物后荭草素、牡荆素、木犀草苷和槲皮苷这4个成分在脑中含量最低，说明其较难通过血脑屏障。荭草素、牡荆素和槲皮苷主要分布在肾脏，肺和肝脏也有较高的分布; 而木犀草苷对肺和肝表现出较强的亲和力，在肾脏中分布很低。Cheng等[22]建立利用LC-QQQ-MS快速测定大鼠体内淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ的含量的方法，并发现淫羊藿苷和淫羊藿次苷Ⅱ在不同的给药途径下，具体截然不同的药代动力学特性，灌胃给药后约91.2%淫羊藿苷转化为淫羊藿次苷Ⅱ而筋脉注射后仅有0.4%淫羊藿苷转化为淫羊藿次苷Ⅱ。Luo等[23]首次建立利用LC-QQQ-MS快速测定六角英中的爵床脂素和6-羟基爵床脂素的方法并应用于大鼠灌胃六角英提取物后的药代动力学研究。

3.2 液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱(LC-Q-TOF-MS) 飞行时间分析器(TOF):具有相同动能, 不同质量的离子, 因其飞行速度不同而分离。如果固定离子飞行距离, 则不同质量离子的飞行时间不同, 质量小的离子飞行时间短而首先到达检测器。各种离子的飞行时间与质荷比的平方根成正比。离子以离散包的形式引入质谱仪, 这样可以统一飞行的起点, 依次测量飞行时间。TOF具有较大的质量分析范围和较高的质量分辨率, 尤其适合蛋白等生物大分子分析, 常用MALDI为离子源，其分辨率随着质荷比的增大而降低。

将四级杆和飞行时间分析器结合后(LC-Q-TOF-MS)，会极高的提高准确率和分辨率，具有很高的灵敏度，在样品组份结构分析，代谢组学研究上具有较高的优势。董世奇等[24]运用LC-Q-TOF-MS对甘草苷在大鼠体内的代谢途径进行研究，对大鼠血浆、尿液、粪便和胆汁中的代谢产物进行结构结构鉴定与确证，研究表明甘草苷口服后在 血浆中的主要存在形式为甘草素的硫酸结合物；粪便中的主要代谢产物为甘草素和甘草素的硫酸结合物；尿中的主要代谢产物包括甘草素和甘草素的葡萄糖醛酸结合物；胆汁中的主要代谢产物包括甘草素的葡萄糖醛酸和硫酸结合物。单进军等[25]运用LC-Q-TOF-MS研究瑞香素在大鼠肠壁产生的代谢产物，采用大鼠在体肠道灌流模型, 分别收集瑞香素0～2h内的十二指肠、空肠、回肠和结肠灌流液,分析肠道灌流液中瑞香素的代谢产物。在大鼠十二指肠、空肠、回肠灌流液中共发现瑞香素原形药物和4个代谢产物, 而在结肠灌流液中未发现代谢产物。并且首次发现了瑞香素-7-硫酸酯和瑞香素-8-硫酸酯为瑞香素在大鼠体内的Ⅱ相代谢产物, 揭示其在大鼠体内代谢的新途径。Sun等[26]给大鼠灌胃百部根混悬液后，运用LC-Q-TOF-MS建立测定大鼠血浆中的活性产物及代谢产物，共28个成分。该方法不仅可以用于快速鉴定百部根中的药用成分，也为传统中药的体内过程研究提供了新的思路。Wu等[27]运用LC-Q-TOF-MS及LC-MS/MS，对中药传统方剂栀子大黄汤在灌胃大鼠体内的代谢产物进行分析，测定61种异生物质和代谢产物。Wang等[28]利用LC-Q-TOF-MS对乌头的毒性成分在体内的方式进行定性分析。Fang等[29]首先应用LC-Q-TOF-MS对藿苏养胃口服液中的主要成分做出分析，并且应用LC-MS/MS对火树养胃口服液与抗癌药阿帕替尼的体内药动学相互作用做出研究，结果显示火树养胃口服液对人体肝组织液内所有的CYPs都起到抑制作用，并能将阿帕替尼在大鼠血浆中半衰期延长7.5倍，AUC0-∞增加了43%。

3.3 液相色谱-四级杆串联离子阱质谱(LC-Q-IT-MS) 离子阱质谱可以通过调整环状电级产生的不同范围的射频电压来捕获不同质量的离子。离子阱质谱具有很高的灵敏度，可以实现多级质谱的功能。离子阱质谱可以实现在不同时间序列下的多级扫描，可以提供待测组份的离子碎片信息，能够提供鉴定未知成分所需的化学结构信息，因此擅长于定性检测。将四级杆分析器与离子阱串联后，定性和定量检测都能够整合进行。Cao G等[30]运用离子阱串联质谱法对山茱萸在小鼠微透析液中的代谢物进行分析，发现7种新的母体化合及三个全新的代谢产物。

3.4 液相色谱-离子阱串联飞行时间质谱(LC-IT-TOF-MS) 离子阱飞行时间串联质谱由于具备多级质谱功能、高分辨率和高质量数准确度, 因此特别适合同时对多种成分进行整合的分析，对多重裂解的代谢反应有较强的定性功能。Liang等[31]应用LC-IT-TOF-MS对赤芍药在大鼠体内的吸收成分和代谢成分进行定性研究，共测定出13种新的吸收成分和90种新的代谢成分。Yang等[32]应用LC-IT-TOF-MS对紫杉醇在小鼠体内的代谢物进行测定，191种代谢产物(包括153个黄酮类化合物和38个酚类化合物)被定性检出，其中154种为新检测到的紫杉醇代谢产物。Xu等[33]应用LC-IT-TOF-MS测定罗汉果苷Ⅴ在大鼠体内的代谢产物，已及这些代谢产物在各个组织的分布情况。Wang等[34]应用LC-IT-TOF-MS对冬虫夏草中的抗凝血活性成分进行定性，并且对这些抗凝血成分在大鼠体内的代谢产物进行研究。

4 前景与展望

由于LC-MS/MS具有较高准确度和灵敏度，分析过程中选择性强、分离能力好，不仅能对化合物准确定量，还能提供化合物的结构信息，可用于对未知化合物的定性和定量，适合于复杂体系的成分分析，由于中药成分复杂，体内过程所以更多能查询到的是运用LC-MS/MS对中药体内过程研究的文章。在运用LC-MS/MS进行中药体内研究的文献中，又以LC-QQQ-MS占最多数，因为其定量功能更好，虽然其也有定性功能，但是在定性研究方面，LC-Q-TOF-MS和LC-IT-TOF-MS更为突出。LC-Q-TOF-MS更多地被运用于未知中药成分的结构鉴定，其灵敏度、质量分析准确度和分辨率都要高于LC-QQQ-MS，而LC-IT-TOF-MS更擅长于测定多组分代谢产物，目前将LC-Q-TOF-MS和LC-IT-TOF-MS运用于中药成分体内过程研究的文献还较少。值得一提的是，LC-MS/MS法运用于中药体内成分的研究，仪器测量只是最终的定性和定量过程，由于生物样品基质成分复杂，会对仪器分析带来较大干扰，所以样品的前处理也尤为重要，目前主要的样品前处理主要有三类，分别是液液萃取法，固相萃取法和蛋白沉淀法。液液萃取法是利用待测组份在不同溶剂中的溶解性不同，从而将待测组分从生物基质中提纯到化学溶剂中，从而减少生物基质对测定带来的干扰。固相萃取法是液相色谱的一个分支，原理也是利用待测组份和生物基质在流动相和固定相中分配系数的不同从而将生物基质和待测组分分离的方法，液液萃取法的回收率较好，但往往需要较多步骤，耗时较长且引入的误差也较多。固相萃取法有一定的自动化程度和批量处理能力，优点是准确度高、灵敏度好，缺点是成本较高。蛋白沉淀法是用有机溶剂将生物基质变性沉淀，从而得到上层含有待测组份的较为干净有机溶剂，蛋白沉淀法使用成本较低，步骤较为简便，是目前运用较为广泛的前处理方法，缺点是蛋白沉淀法无法完全排除内源性杂质对测量的影响。

随着LC-MS/MS技术的发展，未来的也许会出现更多元、更多级的串联质谱法，LC-MS/MS技术也会朝着更快、更灵敏、更准确的方向发展, 在中药体内过程分析研究中的运用也会越来越广。