蛋白降解靶向嵌合体（PROTAC）药物的非临床评价策略分析

韩俊源＊，李亚娟＊，王海学，王全军

（1.军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒物药物与毒理学国家重点实验室，国家北京药物安全评价研究中心，北京100850；2.国家药品监督管理局药品审评中心，北京100022）

蛋白降解靶向嵌合体（proteolysis-targeting chimeras，PROTAC）是将靶向蛋白募集到E3 泛素连接酶进行泛素化标记，然后通过泛素-蛋白酶体途径将其降解的新型药物分子。PROTAC 分子的发展经历了从第一代基于多肽片段的PROTAC 设计到2008 年开始的第二代小分子PROTAC 设计［1］。降解的靶蛋白从最早的甲硫氨酰氨肽酶、雄激素受体和细胞视黄酸结合蛋白等［2-3］发展到最近的雌激素受体、tau 微管相关蛋白和激酶类等［4-6］。目前涉及的疾病包括癌症、类风湿和神经退行性疾病等［6-7］。基于其作用机制，PROTAC 在消除转录因子和非酶蛋白质等未成药蛋白靶标方面具有巨大潜力。然而，PROTAC 药物对正常功能性蛋白的非选择性降解及其稳定性和血管穿透能力差等，决定了其非临床评价研究不容忽视。目前对于PROTAC药物的研究，重点在于强调药物设计和作用机制，对其非临床评价研究的报道很少。PROTAC药物的研发的关注点之一就是药物的安全性问题。做好非临床安全性评价，有助于更全面地预测临床安全性，更好地推动其进入临床研究，最终用于人体疾病治疗。本文对PROTAC药物的发展历程以及其优缺点进行概述，重点对PROTAC药物的非临床评价策略进行详细分析，以期为PROTAC药物的研发提供参考。

1 PROTAC药物研发概况

2004 年诺贝尔化学奖授予了以色列科学家Aaron Ciechanover，Avram Hershko 和美国科学家Irwin Rose，以表彰他们共同发现了细胞是如何摧毁有害蛋白质的，即泛素调节的蛋白质降解过程。利用泛素调节蛋白质降解这一机制，Crews 和Deshaies 课题组在2001 年最早提出了PROTAC这个概念［8］。最初，PROTAC 只是被作为一种学术活动或如CREWS 所说是一种“可爱的化学珍品”。之后，经过将近20 年的发展，PROTAC 被认为是一种新的药物发现模式并可能会成为重磅炸弹疗法［9］。PROTAC 是一种异双功能小分子，由3 部分构成，中间的连接体（linker）一端连接目标蛋白的抑制剂（结合靶蛋白的配体），另一端连接E3 泛素连接酶的结合配体分子［10-11］。PROTAC 将靶向蛋白募集到E3 泛素连接酶进行泛素化标记，然后通过泛素-蛋白酶体途径将其降解。泛素-蛋白酶体系统的正常生理功能是清除细胞中变性、突变或有害的蛋白质［12］。PROTAC 是一种全新的药物设计策略，通过设计这样的三联体药物，理论上可以将任何过表达和突变的致病蛋白清除，从而治疗疾病。

2001 年，Crews 和Deshaies 课题组利用与泛素连接酶E3 体系S 期激酶相关蛋白1-cullin-F 盒蛋白〔S-phase kinase-associated protein 1（Skp1）-cullin-F-box protein，SCF〕结合的10 肽，加上甲硫氨 酰 氨 肽 酶2（methionine aminopeptidase 2，MetAP2）的共价抑制剂ovalicin（天然产物），设计并合成了首个用于降解MetAP2 的PROTAC-1［8］。蛋白试验验证了PROTAC-1 可快速降解MetAP2，但由于使用的10 肽上有磷酸化的丝氨酸，导致PROTAC 分子无法透过细胞膜。为解决这个问题，研究者发现一个7 肽ALAPYIP 链接上一个D-精氨酸多聚体，可以使PROTAC成功透过细胞膜，且不被非特异性蛋白酶水解［13］。在这个PROTAC分子中，用ALAPYIP取代抑制性核因子κBα（inhibitor kappa B alpha，IκBα）-磷酸肽组分，是一个人工配体共轭AP21998 靶标（F36V）FKBP12 蛋白质。这种能透过细胞膜的PROTAC 已被证明可以在细胞中破坏其靶蛋白。在稳定表达增强型绿色荧光蛋白-（F36V）FKBP12 的HeLa 细胞中，加入PROTAC靶向的（F36V）FKBP12，观察到绿色荧光减弱。Western 印迹法也证实，PROTAC 导致（F36V）FK⁃BP12 发生降解。细胞渗透PROTAC 的发展，为靶向体内致病蛋白提供了可能，在细胞生物学特别是药物开发中的应用展现出前景。2008 年以前的PROTAC 均使用了多肽，虽然已经可透过细胞膜，但多肽PROTAC本身相对分子质量较大且肽键不稳定，导致合成、纯化和稳定性方面的诸多问题。为克服这一系列问题，研究者采用“全小分子”的PROTAC设计。全小分子PROTAC通过小分子配体去募集目标蛋白和E3泛素连接酶，快速靶向降解蛋白，有更好的细胞渗透性。苄林环连接酶（culin-ring ligase，CRL）E3 泛素连接酶复合物〔如鼠双微体蛋白2（murine double minute 2，MDM2）、细胞凋亡抑制蛋白1（cellular inhibitor of apoptosis protein 1，cIAP1）、重组小脑蛋白和VHL〕和与一些E3泛素连接酶或基质受体蛋白结合的多种小分子已用于PROTAC开发。

以磷酸化酪氨酸结构域（phosphorylated tyro⁃sine binding，PTB）或非受体酪氨酸激酶同源结构域（Src homology 2，SH2）的招募蛋白为降解靶标，可使酪氨酸激酶信号通路失活，从而抑制肿瘤细胞增殖。基于这一理念，有研究者开发了一种磷酸化依 赖 的PROTAC（phosphoPROTAC）［14］。phos⁃phoPROTAC 通过靶向下游效应蛋白降解，从而使受体酪氨酸激酶信号通路激活，而对正常细胞的毒性非常低，因为它通常只抑制发生在癌细胞中的受体酪氨酸激酶信号的激活。依靠酪氨酸激酶相互结合，磷酸化多肽PROTAC可降解不同信号转导途径的靶蛋白，在“无成药性”（undruggable）靶蛋白的药物设计领域有所突破。另外，HEIGHTMAN 小组［15］开发了一种名为CLIPTAC的先进PROTAC技术。CLIPTACS 是由2 个小前体分子在细胞内组装成的PROTAC，该技术实际上是基于重组小脑蛋白的PROTAC，由四苯标记的沙利多米德衍生物（Tz-thalidomide）的快速反应形成，在细胞中具有跨环环-八烯标记的配体。此CLIPTAC 可以同时招募靶蛋白和E3 连接酶重组小脑蛋白，促进目标蛋白的蛋白酶体降解。2 个独立的小前体分子能够自组装，在细胞中形成功能性PROTAC，因为其相对分子质量更小而具有更好的渗透性。

2013 年，Crews 创立了生物技术初创公司ARVINAS，为临床应用开发PROTAC技术。2017年，ARVINAS 选择了用于治疗前列腺癌的雄激素受体PROTAC和乳腺癌的雌激素受体PROTAC 作为首批临床试验候选药物［16-17］。ARV-110 是ARVINAS临床评估的第一个PROTAC蛋白降解剂。目前，在转移性抗性前列腺癌患者中，ARV-110 已经完成第一阶段的临床试验。结果显示，35，70和140 mg剂量组耐受均良好，无剂量限制毒性，也未观察到2，3或4级相关不良事件［18］。

2 PROTAC药物研发特点

2.1 PROTAC药物优势

目前，小分子抑制剂是靶向细胞内蛋白的主要治疗手段。然而小分子抑制剂有比较明显的局限性，其靶蛋白通常是具有囊泡或者活性位点的酶和受体，这就导致占人类蛋白组活性位点约75%的转录因子、支架蛋白和非酶蛋白在小分子抑制剂中无成药性［19］。此外，小分子抑制剂持续的高全身药物水平来维持足够的细胞内药物浓度达到治疗效果，这往往会使小分子抑制剂由于其竞争的特性导致脱靶效应和不良反应。这些限制严重阻碍了小分子抑制剂的开发和临床使用。

PROTAC 是一种利用蛋白酶水解靶向嵌合体的蛋白质降解策略。将目标蛋白质募集到E3 泛素连接酶进行泛素化标记，然后由蛋白酶体介导降解。泛素-蛋白酶体系统的正常生理功能是清除细胞中变性、突变或有害的蛋白质。通过泛素-蛋白酶体系统破坏致病蛋白，而不是使用传统的小分子抑制剂抑制它们，从而提供了更有效的策略［20］。许多研究表明，降解蛋白质比抑制蛋白质具有更好的抗癌活性［21］。PROTAC 药物的一个关键优势是可降解“无成药性”靶蛋白。

此外，理论上PROTAC只需少量的催化药物即可降解细胞内几乎所有的蛋白质（包括膜蛋白），因此其具有广阔的应用前景。

2.2 PROTAC药物成药难点

尽管目前研究者已采用全小分子的PROTAC设计策略，但其相对分子质量高导致的水溶性、口服吸收和透膜性均较差，同时PROTAC药物的化学合成成本也较高。同时，必须意识到目标蛋白可能在其他正常生理活动中发挥作用，如果PROTAC药物不能区分正常和病理组织，那必将会引起程度不等的不良反应。

另外，PROTAC 药物的脱靶毒性更值得关注，因为泛素化标记不仅涉及到蛋白质降解，还关系到甲基化、乙酰化和磷酸化等过程；不仅涉及蛋白质，还涉及到DNA。就像沙利度胺对胎儿的致畸性一样，其脱靶效应在非临床毒性筛选中不易检测和跟踪，其长期和生殖毒性是一个严峻的问题。

3 PROTAC药物的非临床评价策略

全小分子设计的PROTAC 药物与传统小分子药物在体内的行为类似，非临床安全性评价可以参考传统小分子药物进行，但研究过程中还需针对PROTAC 的特性而对实验设计进行调整和优化。结构中含多肽的大分子PROTAC 药物的非临床安全性评价，可以沿用多肽或抗体的评价思路进行。

3.1 药理药效评价

PROTAC 是事件驱动，而小分子抑制剂和抗体药物是占位驱动［22］。占位驱动是经典受体药理学的一个标志，需要高药物浓度以保持目标占用水平，提供足够的临床疗效。然而，药物浓度高也与脱靶效应有关，可通过具有高特异性和良好的药动学特性的药物来降低脱靶效应。相反，PROTAC 具有催化作用，因此能够在较低含量催化诱导蛋白酶体降解靶标［23］。

离体细胞水平已证实一些蛋白，如雄激素受体、雌激素受体、雌激素相关受体α 和溴结构域蛋白4，已可通过PROTAC 靶向破坏［23-27］。在体药效研究中，PROTAC 药物的非临床评价首先需要确定种属，即建立能够表达PROTAC药物靶蛋白的动物模型。如果PROTAC药物的靶点仅在人体内表达，可通过开展替代分子在体药效研究进行验证；其次，动物药效模型需尽量选用能反映疾病发病机制的模型，即应为致病蛋白（PROTAC 的靶蛋白）引起的疾病模型，才能更准确地模拟相应的疾病，验证PROTAC的药效；同时，药效研究需要设置不同的给药剂量对量效关系进行验证。药效除观察指标外，应尽量选择合适的药效标志物，如通过Western 印迹法等对目标（致病）蛋白的表达量进行测定，以验证PROTAC药物对靶点的选择性。

此外，由于PROTAC在药动学方面与经典的抑制剂不同，高浓度时经常会观察到“HOOK 效应”［28］。在高浓度情况下形成的PROTAC∶E3 连接酶和PROTAC∶POI 二元复合物，可阻碍靶蛋白降解所必需的三元复合物的形成。因此，药效实验要结合药动学/药效学参数设置给药剂量，避免二元复合物的形成，制定合理的给药方案。

3.2 代谢分析

PROTAC 分子必须与靶点蛋白和E3 泛素连接酶形成有效的三元复合物，才能实现靶蛋白降解的特性。因此，只有成功透过细胞膜进入细胞的PROTAC 才具有成药性［22］。一旦进入细胞内，蛋白质降解分子必须同时与目标蛋白和E3 泛素连接酶形成三元复合物，避免形成二元复合物。三元复合物一旦形成，泛素必须以足够的速率（快于三元复合物的本征寿命）转移到靶蛋白受体位点上（通常是表面赖氨酸），所需底物的诱导泛素化也应以同样的速率进行，以避免由二氢奎素酶竞争性去除泛素。最后，泛素转移到底物蛋白上的模式应允许蛋白酶体容易识别，从而开始实际降解［30-32］。因此，在代谢研究中除关注PROTAC 药物本身的药动学特性外，还需要重点关注三元复合物的形成和稳定性问题。如果是由小前体分子在细胞内组装成的PROTAC 的前药，还要关注起药效作用的“组装产物”及其代谢产物的药动学特性。

生物利用度低、稳定性和血管穿透能力差是PROTAC应用受限的主要原因，因此在代谢研究中首先要通过质谱确定体内外代谢产物的种类和结构，包括是否存在二元复合物以及游离个体，弄清药物进入体内后的代谢途径。在PROTAC 药物的动物种属选择上，需要考虑靶蛋白在各动物种属中的表达情况，需选取蛋白表达情况与人类相近的动物为相关种属；进一步的动物种属选择可参考小分子药物的种属选择方案，通过体外肝微粒体和肝细胞代谢实验，确定不同种属中代谢产物种类和比例，为种属选择以及毒理试验中需要监测的代谢产物提供参考依据。代谢研究需要药物对肝代谢酶的鉴定以及对代谢酶的诱导和抑制作用，为临床上药物的相互作用提供参考。此外，基于PROTAC本身的作用特点，在代谢研究中需要关注药物与血浆蛋白结合的问题。综上所述，在进行代谢研究时，建议小分子PROTAC 进行的实验包括不同动物种属体外肝微粒体和肝细胞代谢产物鉴定和稳定性实验，最好加做不同种属体内血浆中代谢产物的鉴定实验、CYP 酶亚型鉴定实验、CYP 酶诱导和抑制实验，血浆蛋白结合实验、血浆稳定性实验和相关种属的体内药动学、组织分布和排泄实验。

PROTAC 的相对分子质量范围一般为70～1000，与传统小分子药物相比，较大的相对分子质量使PROTAC 口服吸收更具挑战性。但一旦被吸收，PROTAC 与传统小分子药物在体内的循环无差异。经静脉、腹腔或皮下注射PROTAC，其在体内表现出与传统小分子药物相似的代谢特点，暴露量与给药剂量相关，优化的PROTAC会有较低的肝清除率。另外，对于结构中含有多肽的大分子PROTAC药物，需参考大分子药物代谢研究程序，并且需对药物的免疫原性进行验证。

3.3 非临床安全性评价

PROTAC药物安全性问题除需要考虑药物整体的安全性外，还需确定药物进入体内后PROTAC的连接子是否会断裂，组成药物的3 个部分是否会分离，继而需要考虑各部分单独的安全性隐患。在毒理研究中，针对PROTAC的稳定性、生物分布和血管穿透能力差的特性，要充分考虑其代谢产物和（或）形成的复合物的毒性，及其因蓄积引起的脏器损伤问题。

安全性评价研究需进行一般毒理、安全药理、遗传毒理和生殖毒理等研究。基于PROTAC 药物的作用机制特点，剂量-毒性反应关系可能有别于传统的小分子药物，所以在进行实验的剂量选择时，需进行充分的预实验探索，最终确定起效剂量与毒性反应剂量之间的关系。

PROTAC 药物的安全性评价中，动物种属的选择与其他药物相同，需要首先确定药物的相关种属。但针对PROTAC的特殊性，首先需要考虑动物种属中靶蛋白的表达情况，优先选取蛋白表达与人类相似的动物为相关种属。进一步的动物种属选择中全小分子PROTAC 药物可参考小分子药物的种属选择方案，依据代谢产物研究的结果来确定；结构中含有多肽的大分子PROTAC药物，可参考多肽或抗体药物的安全性评价思路，使用多种技术（如免疫化学或功能活性评估）确定相关种属［33］；选取药物代谢与人类更为相似的动物种属进行安全性评价。

全小分子的PROTAC 药物的剂量选择可参照小分子药物的实验设计思路，从单次给药剂量递增实验到不同剂量连续给药实验，确定正式实验的给药剂量。建议正式实验时根据前期的结果最少设置3 个给药剂量，以确定剂量-毒性反应关系。由于PROTAC 通过在亚化学计量的水平上催化诱导蛋白酶体降解靶标而起到药效作用，理论上其药效剂量相当于催化剂的量。所以在安全性评价尤其是安全药理研究中，在设计实验的低剂量时应充分考虑与药效剂量之间的关系。剂量选择不宜过高，与药效剂量相当或稍高于药效剂量即可。同时，基于使用高浓度PROTAC 时会观察到“HOOK 效应”这一特性，在实验过程中PROTAC很可能会达到暴露量饱和的情况。但在非临床安全性评价研究中，建议在饱和时观察到的毒性反应严重程度较轻时，继续适当升高剂量或达到适当的限制剂量，在监测药物暴露量的基础上，观察在“HOOK 效应”形成二元复合物的情况下，药物潜在的毒性反应，以更好地指导临床安全性研究。针对大分子的PROTAC 药物，剂量选择也应能提供反映剂量-反应关系的信息，包括毒性剂量和未见不良反应剂量（no observed adverse effect level，NOAEL）；对于某些毒性很小或无毒性的产品，可能无法规定一个特定的最大给药剂量。在此情况下，应提供剂量选择依据及其预计的人体暴露量倍数。选择高剂量时，应该考虑其预期的药理和生理作用、合适受试物的可获得性及预期的临床应用［28］。

PROTAC 药物的非临床安全性评价重复给药实验的给药周期，需结合临床试验以及药物上市后治疗期限进行综合考虑，实验的给药周期需长于药物的治疗期限以支持临床试验或药物上市（参考ICH M3的要求进行）。临床试验最长期限≤2周的药物，重复给药实验最短期限为2周；6个月的啮齿类动物实验和9个月的非啮齿类动物实验通常可支持给药期限≥6个月的临床试验［34］。同时，在一般毒理试验中，需要设置足够长时间的恢复期，以考察停药后不良反应的恢复情况。给药频率根据药物的药效/药代参数和临床拟用频率进行设计，试验中的给药频率需≥临床的给药频率。

在进行PROTAC药物安全性评价时，基于其独特的化学结构，除需要考虑药物整体的安全性外，也需要考虑各组分的潜在毒性问题。首先确定分子在不同动物种属内连接断开及其代谢情况，测定游离状态各组分及其代谢产物的占比。在安全性评价过程中，如果人体中游离状态的组分及其代谢产物的暴露量超过动物中的暴露量时，需要单独对游离组分或其代谢产物进行非临床评价。

PROTAC 药物的安全性评价试验的检测项目及指标可参照常规药物的检测进行，在一般毒理试验中主要需包括临床观察、摄食量、体重、眼科检查、体温（仅非啮齿类）、血压和心电图检查（仅非啮齿类）、血液学和血液生化学检测、尿液观察和分析、大体剖检和组织病理学检查等；安全药理试验需要对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的功能进行研究，同时针对可能存在引起人体其他系统担忧的特定PROTAC药物，需根据具体情况进行安全药理学的补充试验（如肾/泌尿系统、自主神经系统、胃肠道系统等）［35］；遗传毒理试验中，除需要将PROTAC 当作一个整体，通过体外和体内遗传毒性试验组合的方法进行遗传毒性的研究外，针对在体内会发生连接断开和代谢的PROTAC药物，还需要对游离各组分进行遗传毒性的检测；生殖毒性试验针对临床用药人群，在适当的时候分阶段进行，可在其他药理和毒理试验已获得部分结果后，参考有关潜在生殖毒性信息的基础上开展研究［36］；重复给药试验的伴随毒代检测至关重要，可以通过暴露量作为风险控制的重要依据，PROTAC 药物除需要监测母药的暴露量外，还需结合不同种属中代谢产物鉴定的结果，对可能存在的表达量较高的游离组分、形成的复合物以及代谢物进行监测；大分子的PROTAC 药物需要同时进行免疫原性评估，以及监测是否有抗药抗体的产生。

脱靶毒性是业界最为关注的问题之一。传统靶向蛋白活性的大分子和小分子药物，甚至小核苷酸，对蛋白活性的抑制一般不会太彻底，多不影响骨架蛋白的表达，这样虽然增加了耐药性发生的概率，但残留活性也可能保障正常细胞、组织器官基本的生理活性，降低潜在毒性。PROTAC 降解靶标更为彻底，即使是以前验证过的靶点，会不会带来严重的毒性需要进行确证。脱靶效应在毒性筛选中不易检测和跟踪，增加了后期开发的风险。因此，在非临床安全性评价研究中应对PROTAC的脱靶毒性进行重点关注。

4 结语

迄今为止，PROTAC 技术已被应用于不同的靶点，从蛋白酶到核激素受体、表观遗传因子和激酶等。PROTAC 技术在不可成药靶点的应用，有望解决目前80%蛋白因无可作用靶点而缺少调控的现状，是未来可进一步研究和探索的内容。尽管PROTAC 技术从肽到全小分子有了显著的提升，稳定性、溶解度、血管穿透能力和组织分布得到了一定程度的改善，但与传统的小分子药物相比，以上问题依然是非临床研究所面临的难题。改进PROTAC 的药动学、生物利用度和组织分布，进一步降低相对分子质量和毒性，需今后进一步研究。