低氧预适应下DNA甲基化调控BDNF和Trk B受体的研究进展*

张世纪，付 翁，谢雅彬，谢 伟△，刘 远

（1包头医学院内蒙古自治区低氧转化医学重点实验室与神经科学研究所，内蒙古包头014040；2包头医学院医学技术与麻醉学院，内蒙古包头014040；3首都医科大学宣武医院低氧适应转化医学北京市重点实验室，北京100053；4包头医学院第二附属医院，内蒙古包头014030）

低氧预适应（hypoxic preconditioning，HPC）是指机体在经历一次或多次短暂、非致死性低氧刺激后，获得的对更严重甚至致死性低氧/缺血刺激的耐受性，被认为是机体抗低氧/缺血的一种内源性保护现象［1］。虽然HPC可以明显减轻组织、器官尤其是神经系统的低氧/缺血损伤并产生保护作用［2-3］，但其分子机制还不甚清楚。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及其受体原肌球蛋白相关激酶B（tropomyosin-related kinase B，TrkB）广泛分布于中枢神经系统内，二者结合后，通过激活BDNF/TrkB信号通路来影响神经元分化、发育、突触可塑性等过程，并在神经系统中发挥作用［4-5］。已有研究指明BDNF和TrkB是HPC对机体产生保护作用的重要因子［6］，但是HPC调控两者表达的具体机制还有待研究。DNA甲基化是表观遗传学的一种修饰，也是基因表达调控强有力的手段，且在一些神经系统疾病中发现DNA甲基化调控BDNF或TrkB表达的现象［7］。此外，有研究显示HPC可能对DNA甲基化产生影响［8］。因此本综述在HPC条件下探讨DNA甲基化调控BDNF和TrkB的机制，为后续HPC的神经保护机制研究提供参考资料。

1 HPC与BDNF和Trk B的关系

1.1 HPC对神经系统的保护机制HPC神经保护作用的研究于1986年开始，研究表明HPC可在新生儿缺氧缺血、炎症［9］、脑卒中［1］、脑外伤性损伤［10］、应激等低氧/缺血刺激中产生明显的神经保护作用［4］。Xu等［11］的研究得出，HPC通过增加白质中神经纤维束单束的面积来减轻新生儿低氧/缺血损伤导致的白质神经纤维束数量减少；还可以通过激活少突胶质祖细胞的成熟并抑制过度的小胶质细胞活化来部分恢复白质的异常发育，从而促进新生儿感觉运动和认知功能碍的长期功能恢复。由创伤性脑损伤引起的脑缺氧缺血会导致神经元凋亡，HPC通过上调低氧诱导因子1α表达诱导葡萄糖转运体1和葡萄糖转运体3蛋白水平升高，从而改善神经元的葡萄糖转运能力，最终抑制神经元的凋亡［12］。多发性硬化症（multiple sclerosis，MS）是中青年人群中常见的自身免疫性神经系统疾病，HPC可通过抑制血管细胞黏附分子1和细胞间黏附分子1的表达，增强中枢神经系统血管完整性，并减轻MS导致的感觉异常［13］。还有研究表明，HPC通过上调缝隙连接蛋白43表达，抑制c-Src蛋白活性，维持海马CA1区中星形胶质细胞谷氨酸转运蛋白1和谷氨酰胺合成酶的活性，以对抗短暂全脑缺血导致的神经元谷氨酸过度释放，防止细胞外谷氨酸积累，减轻短暂全脑缺血造成的神经元死亡［14］。总之，HPC可能通过低氧诱导因子1α或其他转录调控机制而上调“好基因”表达或下调“坏基因”表达，从而发挥其神经保护作用［15］。

1.2 BDNF和TrkB在神经系统功能中的作用BDNF是德国神经生物学家Barde在1982年首次从猪脑中分离纯化出的一种碱性蛋白，是神经营养因子之一［16］。BDNF在下丘脑、杏仁核、海马、新皮质等脑区高表达，参与各种神经活动［17-18］。BDNF通过2种不同的受体系统发挥作用，即高亲和力的TrkB受体和低亲和力的p75受体，p75是所有神经营养蛋白的常见非特异性受体［16，19］。TrkB在学习、记忆、奖励等各种生理过程中起重要作用［20-21］。BDNF与TrkB结合后能激活3个主要的细胞内信号级联反应，分别是Ras-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-Akt途径和磷脂酶Cγ（phospholipase Cγ，PLCγ）-Ca2+途径［21-23］。以上信号途径可以增加BDNF的表达和分泌，提升海马锥体神经元的树突状棘密度，并诱导海马长时程增强（long-term potentiation，LTP）产 生［5，24-25］。此 外，BDNF和TrkB的表达变化与多种神经退行性疾病有关，BDNF水平降低和TrkB信号丢失在阿尔茨海默病、亨廷顿氏病和其他神经退行性疾病的发病机制中起着重要作用［16，22］。BDNF和TrkB及其信号通路被认为是正常神经系统生理功能实现的关键因子，因此调整其表达或信号通路活性可能是预防和治疗一些神经系统疾病的重要靶点。

1.3 HPC与BDNF和TrkB的关系HPC可通过调控BDNF和TrkB的表达发挥其内源性保护作用［26］。HPC小鼠神经元中的BDNF表达上调可激活BDNF/TrkB信号通路，修复神经元损伤并增加神经元突触可塑性［27］。HPC可使神经干细胞中BDNF表达升高，在中枢神经系统病灶中植入HPC处理过的神经干细胞可以促进神经再生并促进运动和感觉功能的恢复［6］。同样，经过HPC处理的人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）也产生了类似的反应，HPC可以上调人UCMSCs中BDNF的水平，将人UCMSCs移植入损伤的脊髓可以促进细胞存活，减少细胞凋亡，抑制损伤脊髓的炎症浸润，同时改善脊髓损伤后的功能恢复［28］。另外，HPC可以通过激活BDNF/TrkB信号通路下游的PI3K/AKT途径，上调内皮生长因子和肝细胞生长因子的表达，促进内皮细胞的增殖、迁移和管状形成，最终抑制由缺血刺激引起的间充质干细胞凋亡［29］。还有研究指出，在大脑海马胶质细胞中过表达BDNF，可增强HPC对氧糖剥夺损伤的神经元和星形胶质细胞的保护作用［30］。此外，HPC同样引起TrkB的表达变化，在HPC处理24 h内，小鼠海马中全长型TrkB的表达上调，同时BDNF/TrkB信号通路的活性升高；HPC处理3 d后截短型TrkB表达下降，而且BDNF/TrkB信号的活性升高，神经功能改善，梗死体积减小，受损神经元得以修复［22］。Lee等［31］发现，HPC后BDNF和TrkB的水平几乎可以恢复到致死性缺血损害前的正常水平，BDNF和TrkB的表达与神经元对缺血性损伤的耐受力有关，有助于神经元对致死性缺血损伤的抵抗。虽然HPC可能通过上调BDNF和TrkB的表达同时激活BDNF/TrkB信号通路来发挥内源性神经保护作用，但是HPC调控BDNF和TrkB表达的机制还需深入研究。

2 HPC与DNA甲基化的关系

2.1 DNA甲基化DNA甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMT）催化下，将甲基转移至DNA分子的碱基上，通过CpG岛的甲基化控制靶基因特异性表达［7］。DNA甲基化是不改变DNA一级结构而调控组织特异性基因表达的可逆过程［32］。生理状态的DNA甲基化在细胞分化、基因表达［33］、胚胎发育［34］、生长、遗传［35］、免疫调节［36］、衰老［37］等过程中起着重要作用，而异常的DNA甲基化与多种疾病的发生、发展密切相关［38］。DNMTs在哺乳动物中主要是DNMT1、DNMT3a和DNMT3b：DNMT3a和DNMT3b的主要作用是从头合成DNA甲基化；DNMT1的主要作用是维持DNA甲基化，负责维持分裂过程中子细胞基因组的DNA甲基化模式［39-40］。

2.2 HPC与DNA甲基化已有证据显示DNA甲基化广泛参与了HPC的内源性保护作用［8］。在研究HPC小鼠海马组织中DNMTs的表达和活力时发现，与正常小鼠相比，HPC小鼠的DNMT3a和DNMT3b表达降低，而DNMT1的表达则不受影响［41］。在胚胎期神经元迁移和定位的研究中得出，HPC可以降低DNMTs活性而使RELN基因（reelin的基因）启动子区CpG岛位点甲基化水平发生不同程度降低，进而促进RELN基因的表达，提高小鼠的空间学习记忆能力［42］。有研究表明，HPC可以通过下调DNMTs表达激活外泌体microRNA-126的表达，提高神经元的低氧/缺血耐受性［8］。有研究证实，HPC可以上调多种脑内神经保护性基因的表达并广泛去DNA甲基化，通过启动基因表达和蛋白质合成而增加神经元对低氧/缺血的耐受性，为脑卒中提供新的治疗策略［43］。在移植心脏祖细胞治疗充血性心力衰竭的研究中观察到，HPC还能通过激活PI3K-Akt途径上调DNMT1和DNMT3b活性，抑制p53基因表达，且不会使p53基因启动子超甲基化；能增强心脏祖细胞的抗凋亡能力并提高其生存率［44］。总之，HPC上调“好基因”表达或下调“坏基因”表达的内源性神经保护机制，很可能是通过双向调控靶基因的甲基化水平来实现的。

3 HPC条件下的DNA甲基化及其对BDNF和Trk B的调控

3.1 DNA甲基化对BDNF和TrkB的调控BDNF和TrkB在突触可塑性和学习记忆中的作用已经被证实是不可或缺的［16］，而最新研究发现DNA甲基化可以通过调控BDNF表达来影响学习记忆［45］。在大鼠海马神经元中，DNA甲基化水平显著降低，伴随BDNF基因表达上调，同时大鼠的学习能力也明显提升［46］。还有研究指出，DNMT抑制剂RG108可以在短时间内增加BDNF表达量，而且伴随着基因启动子中特定CPG岛甲基化的增加，可以增强神经元的突触可塑性，提高认知能力［47］。一部分脑卒中患者会同时患有焦虑障碍，而脑卒中患者BDNF基因的高甲基化则与焦虑有关；BDNF作为卒中后焦虑障碍的易感性标靶，应受到密切监测，以明确焦虑是否发生，特别是在卒中恢复期［48］。还有研究表明，缬氨酸可以降低小鼠海马中DNA甲基化水平，并且上调TrkB表达，从而发挥其抗抑郁样作用［49］。应激可引起大鼠行为异常，并伴有BDNF外显子IV启动子区甲基化增加，引起海马中BDNF表达降低［50］。除了在神经系统，DNA甲基化对TrkB的调节还表现在肿瘤方面。肝癌的发病可能与TrkB基因启动子的高度甲基化有关，TrkB上调可能促进肿瘤的侵袭和转移［51］。另有研究显示，慢性疲劳综合征患者BDNF蛋白水平较高，但BDNF基因甲基化水平较低，可能与患者痛觉过敏有关［52］。以上实验结果表明，在一些神经疾病和精神疾病的治疗过程中，抑制DNA甲基化可以使BDNF和TrkB的表达升高而发挥神经保护作用，从而产生良好的预后。

3.2 HPC条件下DNA甲基化对BDNF和TrkB的调节在HPC条件下，DNA甲基化对BDNF和TrkB表达调控的研究比较少。对精神分裂症的研究表明，低氧会使BDNF的甲基化水平升高，导致学习记忆能力下降；低氧还会让前额叶的DNA甲基化水平降低，造成前额叶活动度降低，这可能是造成精神分裂症的原因［53］。然而HPC的神经保护作用是明确的，我们正在进行的研究显示，HPC可显著提升小鼠的学习记忆能力，而BDNF和TrkB及其信号通路与学习记忆能力密切相关。有趣的是，我们同时发现HPC条件下BDNF的表达水平也显著升高，因此BDNF很可能参与了HPC改善小鼠学习记忆的过程。此外，HPC可降低DNMT3a和DNMT3b的表达，同时在BDNF启动子区域有大量CpG岛，HPC状态下这些CpG岛的甲基化水平降低。因此，DNA甲基化可能是HPC上调BDNF表达的机制，HPC可能通过降低BDNF启动子区域的甲基化水平上调BDNF表达，从而提升小鼠的学习记忆能力。后续的研究将要通过注射DNMT抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷从侧面验证我们的推测。此外，BDNF/TrkB信号通路及其及其下游途径是如何参与HPC提升小鼠学习记忆的过程中，也是我们下一步研究的重点内容。