猫杯状病毒的进化与致病性研究进展

王 洁 ， 廖均乐 ， 钱 鹏 ， 陈亚磊 ， 刘玉秀 ， 习向峰 ， 范 伟 ， 张渊魁 ， 张许科 ， 田克恭

[1. 河南农业大学动物医学院 ， 河南 郑州 450002 ； 2. 国家兽用药品工程技术研究中心 ， 河南 洛阳 471000 ； 3. 兆丰华生物科技(南京)有限公司 ， 江苏 南京 211102]

猫杯状病毒(Feline calicivirus,FCV)是猫上呼吸道疾病主要病原之一，对宠物猫的生命和野生猫科动物的生物多样性产生严重威胁。目前FCV仅有1个血清型，该病毒 RNA依赖RNA聚合酶的低保真度和高错误率使FCV在复制中有较高的基因可塑性，在免疫压力下能较快发生突变，由此造成的免疫逃避是引起猫杯状病毒疫苗免疫失败的主要原因之一。过去50多年，猫杯状病毒在免疫压力下随着时间推移突变出多种可引起猫不同临床特征的新毒株，从传统的引起口腔溃疡和上呼吸道症状的毒株，逐渐突变出现引起猫严重下呼吸道症状如肺炎的高致病性毒株、引起猫跛行的毒株和引起猫毒性系统性疾病的毒株等。FCV基因型众多，对临床诊断和预防带来全新挑战。本文对FCV病原学、病毒进化和致病机理等研究进行综述，对临床多变的FCV的诊断和预防进行思考，以期为FCV的防控提供理论参考。

1 猫杯状病毒分类与基因组

猫杯状病毒为杯状病毒科(Caliciviridae)水疱疹病毒属(Vesivirus)成员[1]，引起猫科动物口腔溃疡、气管炎、肺炎等呼吸道症状和慢性胃肠炎等症状，对宠物猫和大型野生猫科动物如老虎、狮子等带来极大危害[2-4]。FCV是无囊膜单股正链不分节段RNA病毒，直径35～39 nm，核衣壳呈二十面体对称，基因组约7.7 kb。FCV基因组包含3个开放性阅读框(Open reading frame,ORF)，ORF1主要编码非结构蛋白p5.6、p32、p39、p30、p13(vPg)和p76蛋白，即1个蛋白酶和RNA依赖RNA聚合酶[5]。其中vPg蛋白参与病毒的起始翻译和感染，该非结构蛋白的缺失会影响FCV的组装。ORF2编码约75 kDa的衣壳蛋白前体，经蛋白酶切除14 kDa的前导衣壳蛋白(Leader of the capsid protein,LC)后形成成熟衣壳蛋白VP1。VP1蛋白分为S、P1和P2区域，FCV中和表位多集中在P2区域[6]，VP1蛋白在病毒致病性、病毒组装和抗原特异性方面起着重要作用。ORF2包括A～F共6个区域，其中A区高度保守，B、D区和F区相对比较保守，B区组成病毒的核心结构，含潜在的肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP结合位点；F区位于结构蛋白羧基端，位于病毒的表面。B、D区和F区是非中和单克隆抗体的靶点[5]。C区和E区是高变区，E区分由5′端高变区、中心相对保守区和3′端高变区组成。E区的5′端高变区和C区多为病毒中和表位区，该区域的基因多变性是不同FCV毒株血清交叉反应低的原因，C、D区和E区基因的突变会影响FCV的免疫原性[7]。FCV B细胞表位主要位于E区中心保守区域和5′端高变区[8]，位于中心相对保守区域的B细胞表位是FCV可与异源FCV毒株血清发生交叉反应的原因。ORF3编码的次要结构蛋白VP2参与病毒的正确组装，在病毒的复制、成熟、蛋白合成及病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs)的合成过程中起一定的作用[9]。

FCV感染的细胞中，除FCV病毒基因组外，还存在若干长度不一的亚基因组。亚基因组参与编码ORF2和ORF3，5′端和3′端结构与基因组一致[10]。FCV复制过程中RNA依赖RNA聚合酶缺乏校对和低保真度性而具有很强的基因可塑性，这种易于出错的病毒复制机制使病毒在免疫压力下快速做出反应，易于突变逃避机体免疫清除[11]，产生多个基因型FCV，不同基因型之间的同源性为75.9%～98.7%[12]。不同基因型FCV感染引起的主要临床症状有一定的差异，并逐渐复杂化。随着时间推移，感染猫杯状病毒的临床症状从典型的口腔溃疡等上呼吸道症状，逐渐出现下呼吸道疾病(如严重肺炎)、FCV相关关节炎，以及2000年前后出现的高致病性FCV(Virulent-systemic caliciviruses,VS-FCV)引起的发热、口腔溃疡、皮肤溃疡、黄疸、肝等组织坏死的毒力系统性疾病，死亡率高达67%[13]。

2 引起上呼吸道感染的猫杯状病毒

1957年Fastier等[14]在新西兰首次从猫病料中分离到FCV，FCV主要在上呼吸道和口腔部位组织细胞中复制，引起眼鼻分泌物和口腔、鼻镜溃疡，发病率高但死亡率低，多为良性经过。因FCV基因易变异，不同地区流行毒株的基因型均不同，不同毒株的FCV衣壳变异区的差异达到20%～40%[15]。中国广西省流行的引起猫上呼吸道症状的FCV毒株(GX01-13株)的ORF1、ORF2和ORF3基因与疫苗F9株基因氨基酸相似性分别为90.5%、86.5%和88.8%[16]。巴西流行的可致上呼吸道症状的FCV毒株与疫苗F9株之间ORF2中C区和E区的核苷酸序列差异值均为0.8%～50.1%[17]。

3 引起肺炎的猫杯状病毒

FCV不断进化变异出毒力更强、组织噬性从上呼吸道扩散到下呼吸道的毒株。20世纪70年代，FCV感染猫出现肺炎症状，FCV相关的轻度肺炎被认为是FCV典型症状，重度肺炎是FCV非典型症状。FCV自然引起肺炎的相关报道很少，目前对FCV引起肺损伤的相关了解大多来自于试验研究。有研究称，FCV导致肺部感染是由于试验中使用细胞培养中复制的高含量病毒对幼猫进行滴鼻感染[18]。有一些学者提出不同的声音：在自然感染的猫中严重肺炎可能并不罕见[19]。1995 年美国密苏里州暴发了由肺炎型FCV 21223株引起的疫情，流行毒株FCV 21223株与疫苗F9株基因组序列有显著差异(20.4%)。系统进化分析发现，FCV 21223株与VS-FCV毒株的E区序列无显著相关性，且未在FCV 21223株序列上发现VS-FCV毒株的特异性突变；FCV 21223株与经典FCV毒株氨基酸序列相似性达51%及以上[20]。

4 引起跛行的猫杯状病毒

目前有多株FCV分离株被证实与感染猫产生跛行症状有关，如英国的F65株和加拿大的LLK株、2280株。早在1960年Crandell等[21]从美国有跛行症状猫中分离获得1株FCV，并首次复制出跛行综合征猫感染模型。1997年，Geissler等[22]研究发现，FCV导致跛行症状与病毒衣壳蛋白序列无明显关联。系统进化分析显示，猫杯状病毒2280株与其余FCV分离株处于不同分支上，而猫杯状病毒LLK株与其他导致呼吸道症状FCV流行株分散在一起，2280株和LLK株与其他FCV分离株之间有34%～46%核苷酸是可变的，但核苷酸插入现象少见。1999年，Glenn等[23]序列分析后发现F65株、LLK株和2280株与其他FCV分离株在基因序列和系统发育上无明显统一差异。有研究利用肺炎型255株感染猫出现了跛行症状，表明255株改变了原有组织噬性，获得了感染关节的能力，但该变化是否稳定仍需进一步研究[24]。目前，FCV导致猫跛行的遗传标记尚未找到。少数猫接种FCV疫苗后出现FCV型跛行综合征，研究发现部分与FCV疫苗毒株的进化相关[25]。

5 引起全身性疾病猫杯状病毒

1998年以来，美国和欧洲[13,26-27]相继出现以高死亡率及系列临床症状为特点的高毒性FCV毒株(VS-FCV)。2000年，Pedersen等[13]分离的VS-FCV可引起猫严重全身性系统疾病，包括发热(40 ℃以上)、精神不振、呼吸道症状(眼鼻分泌物、口腔溃疡和结膜炎)、肺炎、脱发、皮下水肿、不同程度的皮肤溃疡等症状，部分感染猫还会出现黄疸及病毒血症。VS-FCV感染猫潜伏期短，病死猫剖检可见多器官病变(如肺炎、胰腺炎和肝坏死等)。可引起猫上呼吸道症状和肺水肿、胰腺炎和肝坏死的上海VS-FCV分离株FCV SH/14株的VP1基因与其他VS-FCV毒株同源率为84%～88.5%[28]。猫源FCV SH/14株与虎源TIG-1株有较高相似性，TIG-1株对猫有较高发病率和致死率，表明FCV可在猫科动物间传播。对57株FCV衣壳蛋白E区氨基酸序列分析显示[29]，部分VS-FCV毒株出现特征性氨基酸，即438T、448A和465S，但某些经典毒株也有出现；系统发育分析显示，VS-FCV无明显独立的分支，VS-FCV在E区高变异区域较短，表明突变是在不同FCV毒株进化过程之中逐渐积累而成，极少具有统一性；多元对应分析显示，VS-FCV与经典FCV相比可能有以下特征：第438位氨基酸是具有脂肪链的非极性氨基酸、第440位和第452位不是小氨基酸、第448位是带极性的带正电荷的氨基酸、第455位不是带负电荷的氨基酸、第465位是极性氨基酸以及第492位是一种小氨基酸。

6 猫杯状病毒的致病机理

FCV感染宿主首先吸附到细胞表面与受体结合，通过内吞作用穿过细胞膜，经过与pH相关的病毒脱壳过程，病毒RNA进入细胞质进行复制。猫连接黏附分子-A(Feline junctional adhesion molecule,fJAM-A)是FCV的细胞受体，介导FCV在细胞表面附着和感染性病毒进入，也是杯状病毒科所有病毒成员的主要细胞受体[30]。

FCV通过口腔、鼻腔和眼部分泌物排出，也可在感染猫血液、尿液和粪便中检出。口腔是FCV主要复制部位，口腔溃疡是FCV典型症状，病毒入侵引起上皮细胞坏死，舌头边缘首先出现水泡，随后破裂形成溃疡，鼻镜处也会出现溃疡。在口腔及鼻镜病变部位上覆上皮坏死和中性粒细胞浸润，通常2～3周愈合[18]。FCV引起的肺炎最初由局灶性肺泡炎所致，导致急性渗出性肺泡炎，然后又发展成一种增生性间质性肺炎。Kahn等[31]用255株感染猫，感染首日即在肺泡壁细胞检测特异性病毒荧光，急性炎症后肺泡巨噬细胞增多，胞浆内检测到病毒。随后在支气管和细支气管上皮中也观察到特异性病毒荧光。FCV感染跛行主要为急性滑膜炎、滑膜增厚和关节内滑液量增加，伴有纤维性渗出和巨噬细胞增多。VS-FCV与经典型FCV不同，多种组织器官出现病变，包括肝脏(肝坏死)、胰腺(胰腺炎)和皮肤(皮肤水肿和溃烂)等，感染猫死亡率高达50%以上[13,32]。VS-FCV感染的发病机制尚不清楚，可能包括病毒变异、免疫介导因素以及环境和管理因素。

7 防控

FCV在世界范围流行，感染猫持续排毒数月至数年不等。目前，FCV防制的主要措施是疫苗，FCV疫苗分为弱毒活疫苗和灭活疫苗，国内所用大多为FCV灭活苗。FCV毒株抗原的易变性导致疫苗免疫效果不佳，不能对所有流行毒株完全保护，不能有效预防病毒传播，仅能减轻临床症状。Sato等[33]研究显示，现有疫苗对同源型FCV毒株保护效力较好，但对异源型FCV不能提供有效的免疫保护。另外，FCV毒株之间交叉反应性较差，疫苗免疫后产生抗体对流行毒株的中和率较低。近年来，VS-FCV毒株的出现极大增加了临床对FCV新型疫苗的迫切感。有免疫史的猫对VS-FCV仍易感，研制FCV新型疫苗应考虑FCV基因型众多的问题，可多分离不同地区FCV野毒株，采用疫苗株阳性血清与其进行交叉保护性试验，将试验数据作为疫苗株筛选的依据，提高FCV疫苗对本国野毒株的交叉保护率。

8 展望

FCV通过持续积累基因突变一直进化，进而不同病毒株对宿主组织噬性不断深入，从而导致致病性的改变。利用反向遗传学研究病毒-宿主之间感染性与基因之间的关联，进而利用基因手段研发基因重组疫苗和DNA疫苗。此外，探索VS-FCV的相关遗传标记和明确分子致病机制仍是目前FCV需要不断深入探究的方向，以期早日研发出针对VS-FCV的新型疫苗。