液相色谱串联质谱法测定蜂蜜中咪唑类抗生素

吴明，徐飞

1. 宁夏回族自治区食品检测研究院（银川 750002）；2. 宁夏回族自治区疾病预防控制中心理化科（银川 750004）

硝基咪唑类（Nitroimidazoles）和苯并咪唑类（Benzimidazoles）抗生素是一类用于动物寄生虫治疗的驱虫剂，其中硝基咪唑类药物由于低廉的价格，被广泛用于蜜蜂孢子虫病的预防和治疗[1]。试验证明，蜂蜜中残留的硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素具有明显的致畸、致癌和致突变作用。因此，包括我国在内的许多国家和地区明确规定，动物源食品中咪唑类和苯并咪唑类抗生素不得检出或限定了最大使用量[1-2]。随着生活水平的日益提高，国家监管机构进一步加大对咪唑类药物残留问题的监督，为保证相关法律法规的实施，需要较高的技术水平和仪器设备对蜂蜜中的兽药残留进行检测。具有高检测精度、高灵敏度和高通量等特点的高效液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法成为检测蜂蜜中咪唑类抗生素的主要技术之一[3-7]。由于蜂蜜样品基质中存在大量的蛋白质、脂类和酚类等杂质干扰测定结果的可靠性，且咪唑类药物在多处于痕量水平，因此，在仪器分析之前，必须采用固相萃取法等前处理方法除去杂质干扰和基质效应对结果的影响[3-7]。在前处理方面，采用多次推送过滤净化（m-PFC）法萃取和净化。m-PFC操作简单，只需吸取提取液快速数次通过固相吸附剂，即可在数十秒达到净化目的。m-PFC被广泛用于不同样品基质中农药和兽药的前处理工作[8-10]。在色谱分离方面，硝基咪唑类抗生素在普通C18反相色谱柱上易出现难以保留，以及苯并咪唑类抗生素在C18反相色谱柱峰形差和检出限偏高等问题。试验采用m-PFC净化，分别选用强阳离子交换柱和五氟苯基柱分离分析硝基咪唑类抗生素和苯并咪唑类抗生素，正离子模式下检测蜂蜜中残留的药物取得良好试验效果。m-PFC-LC-MS/MS法操作快速简单、重现性好，可用于蜂蜜中硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

LC-20AD UFLC（日本SHIMADZU）；4000 Q-Trap LC-MS/MS（美国AB SCIEX）；3-30K台式冷冻离心机（瑞士SIGMA）；FMC-1000恒温振荡器（日本EYELA）；Milli-Q超纯水仪（美国MILLIPORE）；B-400均质仪（瑞士BUCHI）和漩涡混合器（德国IKA）。

16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素标准品（天津阿尔塔，1ST9241-100M，溶剂为甲醇，规格100 μg/mL）。

Ultimate NX-SCX柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）和Ultimate NX-PFP柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）（上海月旭科技股份有限公司）；Quick Pro HF-S型净化柱（北京华仁健康科技有限公司，IC-QuE3150-HF-S，150 mg/3 mL）；甲酸（色谱纯，美国ACS）；乙腈为色谱纯（德国Merck）；其他试剂均为国产优级纯。

2018—2019年间采集的30份蜂蜜均为宁夏省风险监测项目抽检样品，采样过程符合国家标准要求，保存于4 ℃冰箱中，备用。

1.2 液相色谱-串联质谱法

1.2.1 硝基咪唑类抗生素的色谱条件

色谱柱采用Ultimate NX-SCX柱（2.1 mm×150mm，3 μm）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样体积10.0 μL；流动相A为0.1%甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，10% B；0.5～2.0 min：10%～90% B；2.0～4.0 min 90% B；4.0～5.0 min，90%～10% B；5.0～7.0 min，10% B。

1.2.2 苯并咪唑类抗生素的色谱条件

Ultimate NX-PFP柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；柱温40 ℃；流速0.3 mL/min；进样体积10 μL；流动相A为0.1%甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱程序：0.0～0.5 min，10% B；0.5～2.0 min：10%～90% B；2.0～6.0min，90% B；6.0～7.0 min，90%～10% B；7.0～10.0 min，10% B。

1.2.3 质谱条件

离子源采用电喷雾离子源（ESI）；扫描方式采用正离子扫描（ESI+）；检测方式采用多反应监测（MRM）；气帘气（CUR）20 psi；电喷雾电压（IS）5 500 V；离子源温度（TEM）550 ℃；雾化气（GS1）40 psi；辅助气（GS2）40 psi。16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的相关质谱参数见表1。

表1 质谱采集参数

1.3 提取净化

1.3.1 提取

准确称取5.0 g蜂蜜样品于50 mL离心管中，加入2.0 g无水硫酸镁，加入10 mL乙酸乙酯，涡旋混匀30s，4 ℃下以7 500 r/min离心5 min，收集上层乙酸乙酯于另一离心管中，加入10 mL乙酸乙酯，重复上述步骤，合并乙酸乙酯，40 ℃下吹干，加入2 mL乙腈，待净化。

1.3.2 净化

将1 mL上述待净化液倒入萃取柱中，推拉柱塞杆将溶液过滤至2.5 mL离心管中，吸入萃取柱中，重复2次，加入1 mL乙腈淋洗柱中残留的净化液，二者合并在50 ℃下用氮气至近干后，用甲醇-0.1%甲酸水（5/95，V/V）定容至1 mL，涡旋混匀30 s，用Nylon多层滤头过滤后，用于LC-MS/MS检测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

硝基咪唑类抗生素是一类强极性化合物，在普通的反相色谱柱上很难被保留，而且峰形较差，影响定性和定量分析，选择Ultimate NX-SCX强阳离子交换柱作为分析柱可大幅提高分析物保留性，而且各目标物均具有良好的峰形（图1）。PFP五氟苯基柱可以满足正相、反相和亲水等分离的要求，尤其适合LCMS/MS，在分析苯并咪唑类抗生素方面具有一定的优势，目标物的峰形和强度均优于传统的C18反相色谱柱（图2）。因此，选择Ultimate NX-SCX柱分析硝基咪唑类抗生素，Ultimate NX-PFP柱分析苯并咪唑类抗生素。另外，比较了甲醇-水作和乙腈-水2个分离体系的效果，结果发现乙腈-水的分离效果较好。为改善峰形和灵敏度，在流动相中加入0.1%甲酸，灵敏度较高，峰形较好。因此，采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.2 基质效应的评价

蜂蜜中16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的提取和净化主要采用乙酸乙酯提取后QuEChERS、m-PFC和MCX-SPE法等方法。如图3所示，乙酸乙酯提取后未经任何净化，该方法操作简单，但基质干扰物多，适合大量样品的筛查，不适合准确的定量分析，所产生的基质效应为30.4%～42.5%，存在强基质抑制现象。QuEChERS法是基于乙腈液-液提取、无水硫酸镁和醋酸钠盐析分层，伯仲胺吸附剂PSA和反相吸附剂C18净化后直接测定。该方法操作简单，但净化效果较差，样液中仍然存在大量基质干扰物，16种生物碱基质效为49.0%～68.7%，依然存在明显的基质抑制现象。m-PFC采用的多壁纳米复合材料和MCX强阳离子柱净化所产生的基质效应分别为80.4%～87.2%和79.6%～90.8%，基质抑制现象得到明显改善。结果表明，多壁纳米复合材料能有效降低基质效应，与MCX法效果相当，优于未净化和QuEChERS法，对目标物具有良好的吸附作用。在进行SPE操作过程中，16种待测目标物与固相萃取填料之间发生分配或阳离子交换等作用时，必须严格控制样液流速小于2 mL/min，才能使得目标物与吸附剂充分作用。因此，SPE法普遍存在操作时间长（活化、上样、淋洗和洗脱）和操作难度较大（复杂基质堵塞筛板）等问题，明显降低实际工作效率。与SPE法相比，m-PFC可通过反复抽拉的净化方式除去样液中的杂质，保证吸附剂与杂质之间的充分作用，目标物依然保留在提取液中，同时降低操作难度，提高工作效率。

2.3 工作曲线和相关系数

为弥补基质的基质抑制效应，试验采用基质空白工作曲线法进行定量分析。由表2可知，16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素在各自线性范围内具有良好的线性关系，线性相关系数r≥0.995 0；方法检出限（S/N=3）为0.03～0.5 μg/kg，定量限（S/N=10）为0.1～1.0 μg/kg。

图1 8种硝基咪唑类抗生素总离子流图（TIC）

图2 8种苯并咪唑类抗生素总离子流图（TIC）

表2 16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的工作曲线、检出限和定量限

接表2

2.4 方法的回收率及精密度

分别取基质空白样品，进行加标试验，设3个加标水平：1倍LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ，上机测定。结果表明，以空白蜂蜜作为加标基质的回收率为80.0%～106.8%，相对偏差（δRSD，n=6）分别为4.1%～6.7%，满足蜂蜜中硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素残留检测的要求。

表3 蜂蜜中16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的加标回收率和相对标准偏差

2.5 实际样品的检测

用试验方法对2018和2019年宁夏省风险监测项目抽检的30份蜂蜜进行检测，其中2份样本（2/30）中检出甲硝唑，含量为1.22和1.78 μg/kg；其余蜂蜜样本（28/30）中硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的含量均低于方法检出限（0.03～0.5 μg/kg）。

3 结论

采用m-PFC净化，分别选用强阳离子交换柱和五氟苯基柱分离分析，LC-MS/MS测定蜂蜜中16种硝基咪唑类和苯并咪唑类抗生素的含量，回收率（80.0%～106.8%）和精密度（＜7.0%）符合相关检测要求。试验方法快速简便、灵敏度高、重现性好，对于加强宁夏地区该项目的监测工作具有重要意义。