响应面法优化羊肚菌液体发酵营养条件

赵航轲 陈 杭 马 薇 羊玉蓉 降初拉尔布 唐 瑶 唐明先

（甘孜州农业科学研究所，四川康定 626000）

羊肚菌（Morchella）隶属于子囊菌亚门（Ascomycota）、盘菌纲（Discomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌属[1-3]，是世界四大珍贵食用菌之一。羊肚菌富含多种氨基酸[4]，除色氨酸外，其余必需氨基酸含量均比面包、牛奶、牛肉等的含量高，还含有39.7%的碳水化合物及24.5%的蛋白质，具有很高的营养价值[5]。此外，研究发现羊肚菌多糖和蛋白质[6]具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化和降低胆固醇等生物活性[7]，对抗肿瘤药物的研究与开发具有重要意义。

随着食用菌产业的发展，菌种的生产要求越来越高，而食用菌液体菌种具有制种周期短、成本低、易操作、纯度高、菌龄一致等优势，在金针菇、黑木耳、杏鲍菇等食用菌生产中广泛应用[8]。目前有关羊肚菌液体菌种研究较少。笔者在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken 响应面法对羊肚菌液体发酵营养条件进行优化，以期为羊肚菌液体菌种制备及菌丝深层发酵提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

（1）供试羊肚菌菌株：六妹羊肚菌（Morchellasextelata）。（2）基础培养基：葡萄糖20 g，酵母粉5 g，KH2PO41 g，VB110 mg，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

1.2 试验方法

1.2.1 菌种活化

将保藏的羊肚菌菌种接种于平板培养基上，置于24 ℃恒温培养箱培养7 d。

1.2.2 羊肚菌液体菌种培养基组分的优化

碳源筛选：取活化后羊肚菌菌块0.5 cm2，分别接种至用玉米粉、可溶性淀粉、玉米芯粉、蔗糖、果糖、乳糖、甘露醇替代葡萄糖的液体培养基中，其余组分与基础培养基相同。250 mL 三角瓶，装液量为150 mL，pH 自然，置24 ℃、130 r/min 恒温摇床，培养7 d。菌丝体用蒸馏水清洗，置55 ℃干燥箱中烘至恒重，称量菌丝体干重，确定最适碳源，并进一步筛选出其最适质量浓度。试验设置5个平行。

氮源筛选：分别取活化后羊肚菌菌块0.5 cm2，接种至用硫酸铵、硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、蛋白胨、黄豆粉、尿素、硝酸钙替代酵母粉的液体培养基中，其他操作同碳源试验。

无机盐筛选：分别取活化后羊肚菌菌块0.5 cm2，接入用MnSO4、KH2PO4、FeSO4、CaCl2、NaCl、K2PO4、K2HPO4、K2SO4替代K2HPO4的液体培养基中，其他操作同碳源试验。

生长因子筛选：分别取活化羊肚菌菌块0.5 cm2，接入用VB2、VB6、VBH、吲哚乙酸、叶酸、烟酸、赤霉素替代VB1的基础培养基中，其他操作同碳源试验。

液体培养营养条件响应面法优化：如表1所示，在上述单因素试验基础上，分别选取碳源（X1）、氮源（X2）、无机盐（X3）、生长因子（X4）4 个因素为考察对象，以菌丝体干重（Y1）为响应值，采用响应面分析法确定羊肚菌液体培养最佳营养条件。

表1 羊肚菌液体培养基4因素3水平试验设计

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

（1）碳源：由图1a、b 可知，8 种供试碳源中以玉米粉为唯一碳源时，羊肚菌菌丝体干重最高（P＜0.05），为4.77 g/L，所以确定玉米粉为试验最适碳源，最适质量浓度为20 g/L。

（2）氮源：由图2a、b 可知，8 种供试氮源中以黄豆粉为唯一氮源时，羊肚菌菌丝体干重最高（P＜0.05），为5.95 g/L，所以确定黄豆粉为试验最适氮源，最适质量浓度为5 g/L。

（3）无机盐：如图3a、b 所示，8 种供试无机盐中以KH2PO4为唯一无机盐时，菌丝体干重最高（P＜0.05），为6.94 g/L，所以确定KH2PO4为最适无机盐，最适质量浓度为1.5 g/L。

（4）生长因子：如图4a、b 所示，7 种供试生长因子中以VB6为唯一生长因子时，菌丝体干重最高（P＜0.05），为8.65 g/L，所以确定VB6为最适生长因子，最适质量浓度为10 mg/L。

图1 供试碳源（a）及最适碳源质量浓度梯度筛选结果（b）

图2 供试氮源（a）及最适氮源质量浓度梯度筛选结果（b）

图3 供试无机盐（a）及最适无机盐质量浓度梯度筛选结果（b）

2.2 响应面优化试验结果

试验结果见表2。

图4 供试生长因子（a）及最适生长因子质量浓度梯度筛选结果（b）

以X1、X2、X3和X4为响应变量，以Y1值为响应值对表2 数据进行处理，方差分析（表3），模型P值＜0.001，因此该模型有意义且达到最显著水平。X1、X2、X3、X4、X1X2、X12、X22、X32、X42项差异极显著，X1X3、X2X3差异显著，X1X4、X2X4、X3X4差异不显著。复相关系数R2＝0.9674，表明相关性好，失拟值P值0.1348＞0.05，实验可信。经Design-Expert 8.0.6软件分析得到预测模型为：

Y1=+11.25+0.53X1+0.62X2+0.25X3+0.70X4-0.46X1X2-0.37X1X3-0.081X1X4+0.31X2X3+0.17X2X4-0.27X3X4-0.93X12-0.95X22-0.93X32-0.99X42

利用回归方程分析羊肚菌菌丝体干重随各因素变化的响应曲面图。由响应曲面图可知玉米粉、黄豆粉、KH2PO4、VB6各因素对菌丝体干重的影响。每个响应面代表2 个独立因素之间的交互作用，另一个因素保持在0水平编码。

玉米粉质量浓度与黄豆粉质量浓度两因素的交互作用极显著：在玉米粉质量浓度较高时，随着黄豆粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重迅速上升至平稳，随后略有下降；在黄豆粉质量浓度较高时，随着玉米粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重迅速上升至平稳，随后略有下降；在玉米粉质量浓度较低时，随着黄豆粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后稳步下降；在黄豆粉质量浓度较低时，随着玉米粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后稳步下降（图5）。

表2 响应面试验设计因素水平及结果

表3 响应面试验方差分析

图5 玉米粉质量浓度与黄豆粉质量浓度两因素的交互作用

黄豆粉质量浓度与KH2PO4质量浓度两因素的交互作用显著：在KH2PO4质量浓度较高时，随着黄豆粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重迅速上升至平稳，随后下降；在KH2PO4质量浓度较低时，随着黄豆粉质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后下降；在黄豆粉质量浓度较高时，随着KH2PO4质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重迅速上升，随后略有下降；在黄豆粉质量浓度较低时，随着KH2PO4质量浓度的上升，羊肚菌菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后稳步下降（图6）。

玉米粉质量浓度与KH2PO4质量浓度两因素的交互作用显著：在KH2PO4质量浓度较高时，随着玉米粉质量浓度的上升，菌丝体干重迅速上升至平稳，随后略有下降；在KH2PO4质量浓度较低时，随着玉米粉质量浓度的上升，菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后稳步下降；在玉米粉质量浓度较高时，随着KH2PO4质量浓度的上升，菌丝体干重迅速上升至平稳，随后略有下降；在玉米粉质量浓度较低时，随着KH2PO4质量浓度的上升，菌丝体干重缓慢上升至平稳，随后稳步下降（图7）。

图6 黄豆粉质量浓度与KH2PO4质量浓度两因素的交互作用

图7 玉米粉质量浓度与KH2PO4质量浓度两因素的交互作用

通过Design-Expert 8.0.6 软件分析，影响羊肚菌菌丝体干重的各因素最优值为玉米粉20.33 g/L，黄豆粉5.34 g/L，KH2PO41.53 g/L，VB610.73 mg/L，此营养条件培养羊肚菌菌丝体干重（理论）达11.54 g/L。

验证试验：为检验培养基优化工艺的可信度，结合实际试验操作的可行性，采用最优营养条件组合进行5 次验证试验，得羊肚菌菌丝体干重为（11.35±0.21）g/L，相对误差为1.62%，该结果确定采用响应面法优化羊肚菌液体培养最佳营养条件是有效可行的。

3 小结

羊肚菌液体发酵周期短，污染率低，生产成本低。季向阳等通过正交试验确定羊肚菌最佳液体培养条件，优化后菌丝体干重最高为9.18 g/L[9]。笔者采用单因素试验结合响应面法对羊肚菌液体培养基进行优化，优化获得的羊肚菌液体培养基培养的菌丝球均匀致密，验证试验得出菌丝体干重为11.35 g/L，与文献报道相比提高了23.64%。研究结果为羊肚菌深层发酵、液体菌种制备及人工栽培提供数据积累和试验参考。