鸡毛在低共熔体系中的溶解再生及其多孔复合材料制备

刘子同，袁久刚，薛 琪，范雪荣，高卫东

(生态纺织教育部重点实验室(江南大学)，江苏 无锡 214122)

低共熔体系的物理化学性质与传统的低温熔融盐相似，因此又被称作“类离子液体”[1]。其通常由胆碱盐和配位剂(如金属盐、金属盐水合物或氢键供体等)组合而成，但与传统的低温熔融盐相比，低共熔体系还具有原料来源广泛、不挥发、无毒、可降解、价格低廉以及容易制备等优点[2-3]。

近年来，低共熔体系在天然高分子溶解方面获得了研究者的广泛关注，尤其是在木质素溶解方面。例如：Tehunen等[4]和Chen等[5]利用氯化胆碱-乳酸低共熔体系对木质素进行溶解，实现了木质素和纤维素的有效分离；Marino等[6]研究了木质素在尿素-氯化胆碱低共熔体系中的解聚；Biswas等[7]发现淀粉也可以溶于草酸-氯化胆碱低共熔体系中。郭振[8]用几种离子液体和低共熔体系实现了糖类化合物的溶解，具有一定成效。蒲磊等[9]用尿素-氯化胆碱低共熔体系溶解纤维素，分析纤维素与该体系的作用方式，证明了该体系能够有效溶解纤维素。这些研究都表明在天然高分子的溶解和再生方面，低共熔体系具有较大的应用前景。

姜哲等[10-11]研究了天然角蛋白在尿素-氯化胆碱低共熔体系中的溶解及其机制，发现尿素-氯化胆碱体系可以对角蛋白纤维进行溶解，但由于缺乏还原性，不能有效打开羊毛中的二硫键，导致溶解效率不高。本文在其研究基础上发现了一种新型的还原型低共熔体系——巯基乙酸胆碱，该体系具有优良的二硫键破坏能力，可用于鸡毛等废弃羽毛的溶解再生，本文研究了该体系对鸡毛角蛋白的溶解机制及再生角蛋白的特征，制备了多孔复合材料。对鸡毛等废弃毛发资源的有效利用具有较好的启示。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

鸡毛，家禽市场自行收集；巯基乙酸胆碱，质量分数95%，上海成捷离子液体有限公司。

XPV600E 电脑型偏光显微镜(上海比目仪器有限公司)；NICOLET is10傅里叶变换光谱仪(美国Thermo Fisher Scientific 公司)；D8 X射线衍射仪(德国 Bruker 公司)；Mini-protean Tetro Cells 电泳系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 脱脂处理

将鸡毛洗净自然晾干后，利用粉碎机进行初步粉碎，过筛之后称取适量粉碎鸡毛粉置于索氏提取器中，用丙酮抽提脱脂48 h，60 ℃烘干后备用。

1.3 再生角蛋白提取

称取1 g脱脂鸡毛粉，将其置于20 g巯基乙酸胆碱中，于120 ℃磁力加热搅拌溶解一定时间，得到黄色混合液，然后向混合液加入适量8 mol/L尿素溶液，静置15 min，采用砂芯漏斗过滤，滤液用透析袋(截留相对分子质量8 000～12 000 Da)透析3天，将可溶性蛋白溶液冷冻干燥，得到再生角蛋白。

1.4 溶解过程观察

将单根鸡毛纤维置于盛有巯基乙酸胆碱的特制载玻片凹槽中，利用热台加热，用数码偏光显微镜观察其溶解过程，拍照记录。

1.5 红外光谱(FTIR)测试

采用KBr压片法分别测试鸡毛粉和再生鸡毛角蛋白粉的红外反射光谱。测试条件：扫描范围 4 000～600 cm-1，分辨率0.4 cm-1，扫描32次。

1.6 X射线衍射(XRD)测试

采用D8 X射线衍射仪分别对鸡毛粉和再生角蛋白进行测试，测试条件：Cu靶，工作电压30 kV，工作电流10 mA，扫描范围5°～50°，步长0.02 (°)/min。

1.7 凝胶电泳(SDS-PAGE)测试

采用Mini-protean Tetro Cells 电泳系统对鸡毛和再生角蛋白分别进行测试，测试使用的SDS-PAGE凝胶质量分数为12%，标准蛋白指示剂为10～270 kDa。

1.8 多孔材料制备

将角蛋白溶液用聚乙二醇(相对分子质量20 000)浓缩至 60 g/L后，加入一定比例的PEG 400(聚乙二醇，相对分子质量400)，在37 ℃下将其混匀，之后将溶液倒入24孔板中，静置脱泡并冷却至室温后，-20 ℃ 冷冻8 h，-40 ℃ 冷冻干燥36 h，即可得到角蛋白多孔复合材料。

1.9 毒理性能测试

按照ISO 10993-5—2009《医疗器械生物学评价第5部分:细胞毒性体外试验》，采用直接接触的方法测试毒理性。取100 μL的 NIH/3T3细胞(小鼠胚胎细胞)悬浮液注入细胞培养板中，在37 ℃，5% CO2培养箱中培养48 h，最后加10 μL细胞计数试剂CCK-8到各孔板中反应1 h，用酶标仪记录450 nm处吸光度，每种样品重复测试3次，计算细胞存活率：

细胞存活率=A1/A0×100%

式中：A1和A0分别为样品和空白样的吸光度。

2 结果与讨论

2.1 鸡毛溶解过程偏光观察

鸡毛在巯基乙酸胆碱中的溶解过程见图1。

图1 鸡毛在巯基乙酸胆碱中的溶解过程(120 ℃)

从图1可以看出，鸡毛在巯基乙酸胆碱体系中可以发生快速溶解，13 min左右即可以完全溶解消失(图1(f))。溶解时，首先发生羽小枝的溶解，之后羽枝和羽轴逐渐溶解变细(图1(b)～(d))，随着溶解时间继续延长，羽枝进一步变细，而羽轴也逐渐断裂(图1(e))。在此过程中，羽轴中的二硫键被巯基乙酸胆碱还原为硫化氢气体(硫化铅试纸检测时变黑)，导致视野中产生较多小气泡(图1(d)～(e))。综合来看，鸡毛角蛋白中的构象以β折叠为主，相对于羊毛等α-角蛋白纤维，其含硫量较低。巯基乙酸胆碱低共熔体系不仅具有较强的氢键拆散作用，而且具有对二硫键的还原能力，在其双重作用下，鸡毛角蛋白可以发生快速溶解。

2.2 再生角蛋白的结构性能表征

2.2.1 化学结构分析

鸡毛及其再生角蛋白的红外光谱图见图2。

图2 鸡毛及其再生角蛋白的红外光谱图

由图2可以看出，鸡毛和再生角蛋白都含有角蛋白的特殊吸收峰，在酰胺A带(3 300～3 290 cm-1)、酰胺I带(1 650 cm-1)、酰胺Ⅱ带(1 540～1 530 cm-1)以及酰胺Ⅲ带(1 243～1 237 cm-1)均有明显的酰胺键吸收[12]，这说明溶解再生的鸡毛角蛋白保留了完好的蛋白结构。相对原鸡毛，再生角蛋白在1 070 cm-1和958 cm-1附近出现了一些新的特征峰，这是胱氨酸一氧化物所引起的伸缩振动吸收峰[13-14]，该吸收峰在原鸡毛角蛋白中基本不存在，初步判断这是由于鸡毛角蛋白在巯基乙酸胆碱溶解过程中，其所含的部分二硫键被还原为巯基，在高温条件下又被空气氧化为胱氨酸所致。

2.2.2 晶体结构分析

为了研究结晶度变化，对其进行X射线衍射分析，鸡毛及其再生角蛋白X射线衍射图谱见图3。

图3 鸡毛及其再生角蛋白X射线衍射图谱

从图3可以看出，鸡毛及再生角蛋白在9°及20°附近都存在明显的晶体衍射峰[15]。与原鸡毛相比，再生角蛋白在20°附近特征峰强度略有下降，但是9°附近特征峰强度有所下降，说明鸡毛在巯基乙酸胆碱溶解再生过程中，二级结构被破坏，再生角蛋白α-螺旋结构和β-折叠都降低，但是无规结构增加。

2.2.3 分子量分析

鸡毛及其再生角蛋白电泳分析见图4。

图4 鸡毛及其再生角蛋白电泳分析

从图4可以看出，原鸡毛角蛋白(图4(b))泳道在35 kDa 以下，在40～170 kDa范围内颜色较浅，但也存在一定分子量分布。经巯基乙酸胆碱再生后的角蛋白(图4(a))，其高分子量区域(20～170 kDa范围)颜色进一步变浅，近乎无色，而低分子量区域(<20 KDa)颜色进一步升高。说明角蛋白在溶解再生过程中由于二硫键等价键的断裂，大部分降解为小分子蛋白。

2.2.4 鸡毛和再生角蛋白的氨基酸分析

鸡毛及其再生角蛋白的氨基酸分析见图5。

Asp—天冬氨酸；Glu—谷氨酸；Ser—丝氨酸；His—组氨酸；Gly—甘氨酸；Thr—苏氨酸；Arg—精氨酸；Ala—丙氨酸；Tyr—酪氨酸；Cys—半胱氨酸；Val—缬氨酸；Met—甲硫氨酸；Phe—苯丙氨酸；Ile—异亮氨酸；Leu—亮氨酸；Lys—赖 氨酸；Pro—脯氨酸。

由图5可以看出，鸡毛经巯基乙酸胆碱溶解再生后，其再生角蛋白中各氨基酸组成与原鸡毛组成相似，但是氨基酸相对含量大部分均有所降低。这是由于溶解再生时，在溶液中会产生部分氨基酸流失；其中，半胱氨酸含量降低50%以上，最为明显，可能是在鸡毛溶解过程中，由于巯基乙酸胆碱的强烈还原作用，使得羽轴和羽枝中存在的大量二硫键被还原，一部分转化成为硫化氢气体，而另一部分则转变为可溶性的胱氨酸氧化物，最终导致含硫氨基酸的大幅度降低。

2.3 角蛋白多孔材料

再生角蛋白多孔材料形貌见图6。

图6 再生角蛋白多孔材料形貌

从图6(a)可以看出，角蛋白/PEG混合材料能够通过冻干法形成均匀的多孔材料，结构较为疏松，具有像海绵一样的弹性。由图6(b)可以看出，再生鸡毛角蛋白截面呈疏松多孔的网状结构，其孔隙大小介于10～100 μm之间，比较均匀，这对于细胞在组织材料上的生长和扩散具有重要意义。对其生物细胞毒理性测试结果表明，再生角蛋白评级为：对细胞无毒，其增殖率 >100%，说明角蛋白具有较好的生物相容性。

3 结 论

巯基乙酸胆碱还原型低共熔体系，具有优良的二硫键破坏能力以及氢键拆散能力，在废弃羽毛等天然角蛋白资源的溶解再利用方面具有广阔的应用前景。

①采用巯基乙酸胆碱低共熔体系可以高效溶解鸡毛，制备鸡毛再生角蛋白。在溶解过程中，角蛋白主体结构并没有完全破坏，但是其结晶度和分子量都有一定程度降低，氨基酸组成也发生了变化，尤其是含硫氨基酸大幅度下降，说明巯基乙酸胆碱低共熔体系能够有效破坏二硫键，因此能够高效溶解鸡毛。

②利用再生鸡毛角蛋白和PEG混合可以制备角蛋白多孔材料，该材料对细胞无毒，在医用材料方面具有广泛的应用。