VEGF-D、P-gp及P15蛋白在脑胶质瘤患者中的表达及与临床病理特征和预后的相关性

向 斌，杜 军，张维波，刘 盛

脑胶质瘤是由神经外胚叶衍化而来的胶质细胞发生的肿瘤，为颅内肿瘤中常见的一种，发病率为36%～63%[1-2]。脑胶质瘤恶化程度高，侵袭力强，临床一般药物治疗无法透过血脑屏障，即使使用放疗临床效果也不明显，手术治疗难以完全清除，术后复发率高[3]。因此，探索新的治疗及早期诊断方法为目前研究热点。既往认为脑胶质瘤的发生与后期发展有多种因素、步骤、基因变异参与。随着分子生物学技术的不断发展，发现恶性肿瘤细胞周期控制紊乱是导致其增生失控从而促进肿瘤发生发展的重要原因[4-5]。因此，本文分析血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、P-糖蛋白(P-gp)及P15蛋白在脑胶质瘤患者中的表达及与临床病理特征和预后的相关性，旨在为脑胶质瘤的临床诊断、治疗及预后评估提供参考。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2017年1月—2019年2月我院收治的经手术后病理检查确诊为脑胶质瘤患者69例的临床资料。纳入标准：临床资料、病理资料完整；签署相关知情同意书；不存在其他影响本研究的疾病；卡氏评分在70分以上；预计生存时间1年以上。排除标准：治疗前存在远处转移者；临床资料不完整者；病理检查前应用放疗、化疗等治疗者；存在免疫或血液系统疾病者。69例中男37例，女32例；年龄30～75(46.35±6.88)岁；胶质瘤Kernohan分级：Ⅰ～Ⅱ级28例、Ⅲ～Ⅳ级41例；肿瘤直径≥5 cm 38例，<5 cm 31例；分化程度：低分化25例，中高分化44例。

1.2方法

1.2.1VEGF-D、P-gp及P15蛋白检测方法：VEGF-D、P-gp及P15蛋白检测均使用免疫组织化学染色。单克隆即用型抗体和免疫组织化学超敏SP试剂盒(SP Kits)均购自福州迈新生物技术公司，所有标本均使用10%福尔马林液固定，常规HE染色切片，并为了防止脱玻片按试剂盒说明书操作，设置已知VEGF-D、P-gp及P15蛋白组织切片为阳性对照，磷酸盐缓冲液作为阴性对照。VEGF-D细胞质呈黄棕色或褐色为阳性表达，P-gp细胞膜或细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达，P15蛋白细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性表达。按照阳性细胞多少判断其阳性程度，随机观察5个高倍镜视野，计算1000个瘤细胞中染色阳性细胞所占比例。无明显显色阳性细胞为阴性，阳性细胞数>10%为阳性。另选取手术治疗时切除的正常组织(距肿瘤灶边缘3 cm，病理检查证实无非典型增生及肿瘤细胞)作为对照。

1.2.2随访：所有患者给予手术后辅助放化疗，在结束后每隔3个月进行复查，根据其影像学检查结果、临床表现、实验室检查结果等作为复查诊断指标。从治疗结束后1周起随访1年。

1.3观察指标 比较69例癌组织、正常组织及不同临床病理特征患者VEGF-D、P-gp及P15蛋白表达情况，分析VEGF-D、P-gp及P15蛋白与脑胶质瘤临床病理特征和预后的相关性。

2 结果

2.1不同组织中VEGF-D、P-gp及P15蛋白阳性表达情况 瘤组织中VEGF-D、P-gp阳性表达率明显高于正常组织，P15蛋白阳性表达率低于正常组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

表1 69例脑胶质瘤患者不同组织中VEGF-D、P-gp及P15蛋白阳性表达情况[例(%)]

2.2临床病理特征与VEGF-D、P-gp及P15蛋白表达的关系 VEGF-D、P-gp及P15蛋白表达与肿瘤病理分级、分化程度有明显相关性(P<0.05或P<0.01)，与性别、年龄、肿瘤直径无明显相关性(P>0.05)。见表2。

表2 69例脑胶质瘤患者临床病理特征与VEGF-D、P-gp及P15蛋白表达的关系(例)

2.3影响脑胶质瘤患者预后单因素分析 治疗后对患者随访1年，根据预后情况分为预后良好50例(72.46%)，预后不良19例(27.54%)。年龄、肿瘤病理分级、肿瘤分化程度及VEGF-D、P-gp、P15蛋白表达情况为影响脑胶质瘤患者预后的相关因素(P<0.05或P<0.01)；性别、肿瘤直径与患者预后不相关(P>0.05)。见表3。

表3 影响脑胶质瘤患者预后的单因素分析(例)

2.4影响脑胶质瘤患者预后多因素分析 经多因素分析可知，年龄>45岁、病理分级Ⅲ～Ⅳ级、VEGF-D阳性表达、P-gp阳性表达、P15蛋白阴性表达及分化程度低为影响脑胶质瘤患者预后不良的独立危险因素(P<0.05或P<0.01)。见表4。

表4 影响脑胶质瘤患者预后的多因素分析

3 讨论

有研究表明，肿瘤的发展、浸润、复发、转移等和肿瘤的血管生成有着密切的关系，肿瘤血管生成与各种调节因子密不可分[6-7]。血管内皮生长因子(VEGF)作为淋巴细胞生长因子同时也属于主要的调节因子[8]，肿瘤的血管生成是由其家族成员和受体之间的相互作用所致[9]。VEGF-D则是其家族中的一员，既往文献研究发现采用fms样酪氨酸激酶4(Flt-4)亲和层析法将VEGF从人前列腺癌细胞中分化后，可激活淋巴管内皮上的受体，提示其属于一种特异性较高的血管内皮细胞有丝分裂元，对淋巴管、血管生成有刺激作用，在与受体VEGFR-2、3结合后可出现信号传导[10]。除此之外大量研究还发现，VEGF-D在肺癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤中均有较高表达[11-12]。VEGF作为重要的促肿瘤血管生成因子，也是影响患者预后的独立危险因素。Flt-4在早期的胚胎血管中发育，在发育后期仅出现在发育中的淋巴管内皮细胞中。VEGF-D则是淋巴生成的重要信号传导通路。本研究发现，VEGF-D在脑胶质瘤瘤组织中表达明显高于正常组织，在不同病理分级、不同分化程度患者中表达有差异，结合既往文献提示其在脑胶质瘤病变、发展中存在重要的作用[13]。

P15蛋白定位于人染色体9p21区上，在神经胶质瘤中，该区基因有着较高的丢失率。已经有研究发现，在脑胶质瘤中存在P15基因缺失情况[14]。孙飞等[15]对脑胶质瘤标本进行检测发现，患者P15基因存在明显缺陷。P15、P16基因缺失则在恶性程度高的脑胶质瘤中多见。P15基因可与CDK4/CDK6结合，抑制该酶活性，阻止细胞进展至G1期，在其缺少后抑制作用降低，癌基因中cyclinD就会占据优势与CDK4/CDK6结合，过度刺激细胞分裂增殖最终导致癌变。本研究正常组织中P15蛋白表达明显高于癌组织，与既往文献结果相符[16-17]。

在临床肿瘤治疗中，肿瘤细胞对于化学药物的敏感性是影响手术治疗效果的主要因素，术后复发概率高和肿瘤对化疗药物耐受性增加有关[18]。既往认为肿瘤治疗中的获得性多药耐药是由抗癌药物诱导产生。有研究通过比较化疗前后患者P-gp的表达情况，了解到化疗组P-gp阳性表达增加，且认为其是获得性或原发性的[19]。徐凡等[20]对未经化疗的原发性脑胶质瘤患者进行体外细胞培养，在其恶变过程中发现P53、ras、MDR1等癌基因被激活现象，且MDR1 mRNA的异常活化导致P-gp的表达增加，出现此类原发性耐药机制是导致患者首次化疗失败的重要原因之一。本研究发现，在正常组织中P-gp并不表达，与既往文献研究结果相符[21]。进一步研究发现，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在脑胶质瘤中的表达与其肿瘤病理分级、分化程度有明显相关性，且VEGF-D阳性表达、P-gp阳性表达、P15蛋白阴性表达为影响脑胶质瘤患者预后不良的独立危险因素。结合既往文献分析，VEGF-D、P-gp及P15蛋白在脑胶质瘤的发展中存在着重要的作用，说明VEGF-D阳性表达、P-gp阳性表达、P15蛋白阴性表达者病情较严重，且术后复发率较高，预后差[22]。

综上所述，VEGF-D、P-gp在脑胶质瘤患者中表达增加，P15蛋白表达降低，三者表达情况变化可为患者治疗方案制定、预后评估提供重要的参考。