辅助生殖技术对子代胎盘组织中HSP70、NF-κB表达的影响及临床意义

王晶晶，陈书强，董 杰，邸 曼，王晓红

体外受精和胚胎移植辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)是通过对配子及早期胚胎进行体外操作，以达到辅助不孕不育夫妇获得妊娠的一系列技术[1]。然而，其安全性也引起生殖医学专家的极大关注。研究显示，与自然妊娠相比，ART子代出现早产、低出生体质量儿、出生缺陷等不良妊娠结局的风险显著增加[2]。胎盘作为孕期特有器官，不仅是母胎营养转运的纽带，还在维持正常妊娠过程中发挥重要的生理作用[3]。多项研究表明，ART子代胎盘出现结构和功能异常，与胎儿生长受限等密切相关[4-6]。热休克蛋白70(HSP70)是热休克蛋白家族中最保守的一种细胞内分子伴侣，可以参与蛋白质的折叠、促进蛋白质泛素化和蛋白酶降解，在保护细胞免受各种外界应激方面发挥着关键作用[7-9]。核转录因子-κB(NF-κB)是1986年首次发现的一种关键性转录因子，几乎存在于所有类型细胞的胞质中，对免疫细胞活化、应激反应、细胞凋亡等具有调节作用[10-11]。本研究拟采用实时逆转录荧光定量聚合酶链式反应及免疫印迹法检测ART和自然妊娠子代胎盘中HSP70与NF-κB的表达情况，并探讨二者变化与ART不良妊娠结局发生风险增加的相关机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月—2019年6月在我院产科分娩的ART子代(ART组)和同期自然妊娠分娩的子代(对照组)作为研究对象。ART组纳入标准：产妇年龄<35周岁，单胎妊娠,新生儿既往产检正常且无出生缺陷,父母双方染色体正常；排除标准：产妇孕前合并严重的内外科并发症(如严重的高血压病、糖尿病、甲状腺疾病等),行胚胎冷冻移植者,行体外受精或接受胚胎植入前遗传学诊断者。对照组为自然妊娠分娩的子代，纳入标准与ART组相同，排除孕前合并严重内外科并发症者。2组进行年龄、孕周、产前体质量指数(BMI)配对，以消除偏移，最终共纳入ART组46例(体外受精-胚胎移植41例、卵胞浆内单精子注射5例)，对照组65例。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2研究方法

1.2.1标本采集：胎盘娩出后，2组各选取20例胎盘，立刻称重，并剪取脐带附着部位的胎盘小叶组织2 cm×2 cm×2 cm，去除母体蜕膜后将胎盘绒毛置于4℃预冷0.9%氯化钠注射液中，漂洗多次至无血迹，分装到冷冻管后立刻置于液氮中冻存1 h，最后转移至-80℃超低温冰箱中保存待用。

1.2.2实时逆转录荧光定量聚合酶链式反应检测mRNA表达水平：将剪碎的胎盘组织加液氮研磨成粉末状，用Trizol法抽提总RNA，用分光光度法进行定量，用逆转录试剂盒获得cDNA，采用SYBR Green试剂盒行实时逆转录荧光定量聚合酶链式反应实验，用2-ΔΔCt法分析数据。引物由上海生工公司设计并合成，见表1。

表1 实时逆转录荧光定量聚合酶链式反应检测胎盘组织mRNA表达引物设计

1.2.3免疫印迹法检测蛋白表达水平：用RIPA裂解液提取2份胎盘组织蛋白后，BCA法测定蛋白浓度，用SDS Loading Buffer变性，处理好的样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后转至聚偏二氟乙烯膜，牛血白蛋白溶液于4℃封闭过夜，洗涤后于37℃加入一抗孵育1 h，洗涤，37℃加入二抗孵育30 min，洗涤后显影。一抗和二抗均购自英国Abcam公司。

1.3观察指标 ①孕产妇基本情况：孕妇年龄、孕周、产前BMI及剖宫产比例；②孕产妇妊娠并发症：妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、前置胎盘(中央性/部分性/边缘性前置胎盘)、羊水异常(羊水过多/过少)、胎膜早破；③新生儿基本情况：新生儿出生体质量，胎盘重量，胎盘效率[新生儿出生体质量(g)/胎盘重量(g)]，早产(胎龄28～37周分娩的新生儿)，低出生体质量(新生儿出生体质量<2500 g)。④检测2组胎盘HSP70、NF-κB mRNA及蛋白表达情况,并分析其相关性。

2 结果

2.12组产妇基本情况比较 ART组产妇年龄(26.54±4.85)岁，孕周(38.78±2.44)周，产前BMI(26.17±3.74)kg/m2，剖宫产比例为54.35%(25/46)；对照组产妇年龄(26.12±4.27)岁，孕周(38.88±2.17)周，产前BMI(25.89±3.65)kg/m2，剖宫产比例为43.08%(28/65)。2组产妇年龄、孕周、产前BMI和剖宫产比例等基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

2.22组产妇妊娠并发症比较 与对照组相比，ART组产妇妊娠期高血压、妊娠期糖尿病、羊水异常发生率均显著升高(P<0.01)，前置胎盘和胎膜早破发生率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组产妇妊娠并发症比较[例(%)]

2.32组新生儿基本情况比较 与对照组新生儿相比，ART组新生儿胎盘重量和早产、低出生体质量比率显著升高(P<0.05)，新生儿重量和胎盘效率有降低趋势但差异并无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 2组新生儿基本情况比较

2.42组胎盘组织中HSP70、NF-κB mRNA表达比较 ART组胎盘组织中HSP70、NF-κB mRNA表达量分别为(2.05±0.92)和(3.11±1.16)，对照组表达量分别为(0.76±0.35)和(1.18±0.65)，ART组胎盘组织中HSP70、NF-κB mRNA表达量均显著高于对照组(P<0.05)，见图1。

图1 2组胎盘组织中HSP70、NF-κB mRNA表达比较 ART组为采用辅助生殖技术妊娠，对照组为自然妊娠；HSP70为热休克蛋白70，NF-κB为核转录因子-κB，ART为辅助生殖技术；与对照组比较，aP<0.05

2.52组胎盘组织中HSP70、NF-κB蛋白表达比较 ART组胎盘组织中HSP70、NF-κB蛋白表达量分别为(2.63±1.05)和(5.36±1.56)，对照组表达量分别为(1.72±0.86)和(2.45±0.89)，ART组胎盘组织中HSP70、NF-κB蛋白表达量均高于对照组(P<0.05)。见图2。

图2 2组胎盘组织中HSP70、NF-κB蛋白表达比较 A为胎盘组织HSP70、NF-κB蛋白印迹条带，B为胎盘组织HSP70、NF-κB蛋白印迹灰度分析结果；ART组为采用辅助生殖技术妊娠，对照组为自然妊娠；HSP70为热休克蛋白70，NF-κB为核转录因子-κB，β-actin为内参基因；与对照组比较，aP<0.05

2.6胎盘组织中HSP70、NF-κB表达相关性分析 Pearson相关分析结果显示：胎盘组织中HSP70与NF-κB表达呈正相关(r=0.865,P<0.05)。见图3。

图3 胎盘组织中HSP70、NF-κB表达相关性分析 HSP70为热休克蛋白70，NF-κB为核转录因子-κB

3 讨论

ART是指在体外对配子及早期胚胎进行的使不孕不育夫妇获得妊娠的一系列操作，但其引发的医源性应激可能致妊娠期并发症及子代健康风险增加[2,12]，具体机制尚未阐明。胎盘由囊胚的滋养外胚层发育而来，是孕期特有器官，其不仅是母胎间营养物质转移的纽带，同时还具有促进新陈代谢、保护内分泌等功能[13]。本研究发现，ART助孕的孕产妇妊娠期并发症发病率显著升高，同时ART子代早产、低出生体质量的发生风险显著增加，这可能与胎盘的结构和功能异常相关。

临床研究显示，特定的应激环境(病理或生理刺激)下，细胞内HSP70将通过细胞坏死和替代途径分泌到细胞外，细胞外HSP70可以发挥趋化因子功能,诱导肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6等炎症细胞因子分泌，促进诱导型一氧化氮合酶的表达和NF-κB发生核移位，进而促进更多炎症细胞因子的释放[14]。研究证实，过度的外源性或内源性应激会导致HSP70水平升高，通过NF-κB信号通路影响精子形成、卵巢早衰和先兆子痫、妊娠期糖尿病、妊娠期高血压、早产等妊娠并发症发生[15-17]。

有研究发现，自然流产患者蜕膜组织中细胞凋亡率、HSP70表达水平均显著高于自然流产患者，推测过度表达的HSP70可能诱导细胞凋亡，从而引起自然流产[8]。也有研究发现，妊娠期糖尿病孕妇的血清及胎盘组织中HSP70和NF-κB p65呈高表达状态，引起胎盘结构和功能的变化并协同促进妊娠期糖尿病的发生[16-17]。还有研究发现，胎盘组织中HSP70 和NF-κB过度表达，可能与子痫前期的发生、发展有关[18]。本研究发现，ART子代胎盘组织中HSP70与NF-κB mRNA和蛋白表达水平均显著升高，且呈正相关。表明在宫内炎症和氧化应激状态下，二者协同作用维持正常妊娠，但是其过度的高表达可能与ART不良妊娠结局相关。

综上，ART可导致子代胎盘组织过度生长，且胎盘组织中HSP70和NF-κB表达水平显著升高，这可能与ART助孕的孕产妇更易发生妊娠期并发症且ART助孕新生儿不良结局发生风险增加有关，但是具体机制尚不清楚。同时，本研究仍存在一些不足之处，如纳入样本量较少且未行亚组分析，后期仍需开展大样本综合性研究。