榛子中的杀虫剂残留GC-MS检测与膳食风险评估

张兴政，李欣宇，程云清，刘剑锋

(吉林师范大学吉林省植物资源科学与绿色生产重点实验室，吉林 四平 136000)

杀虫剂的使用对于农林业的增产增收有重要作用，然而，大多数杀虫剂具有一定毒性，不规范使用将引起严重的化学残留超标问题，给人类健康造成重要隐患[1]。为了保护消费者健康，改进农业资源管理和减少经济损失，许多国家对食品药物残留有着严格的监管制度[2-4]，同时也加强了对农产品质量安全的风险评估。目前对农药残留等有害物累积风险评估方法较多，例如偏离指数点和联合暴露边界、危害指数和累积危害指数等[5]，其中后两种算法因较为简单，其应用更为普遍。

榛子(Corylusspp.)是桦木科(Betulaceae)、榛属(Corylus)植物，果仁富含维生素、酚类化合物、纤维和矿物质，不饱和脂肪酸含量也很高[6-7]。近年来，榛子栽培面积快速增长，对产区的经济发展起到了重要支撑作用。目前，中国榛子的栽培过程中，主要害虫包括榛实象甲[8]、榛椿象和黄达瘿蚊[9-10]等。榛子天然林因以上害虫的危害导致产量极低；大多数杀虫剂都是疏水性的，而榛子果实富含脂肪酸，生产实践中榛子人工果园一般进行多次化学防治，杀虫剂等农药的长期施用无疑加大了化学防治导致残留超标的风险。此前关于坚果中污染物的报道主要关注霉菌毒素。在各种真菌毒素中，黄曲霉毒素是重要的致癌物，因而受更多的关注[11-12]。目前有关榛子坚果中杀虫剂残留的研究还很少，考虑到化学杀虫剂在榛子栽培过程中被广泛应用，为了保护消费者免受杀虫剂残留的影响[13]，有必要对榛子化学防治后导致的农残与摄入后消费者健康风险进行检测与评估。本研究以不同来源的榛子果实、叶片及土壤为研究材料，测定材料中残留杀虫剂(有机磷、有机氯、拟除虫菊酯)的含量，并对检测到的杀虫剂残留进行消费者摄入健康评估，以期为榛子栽培过程中化学农药残留的风险评估提供依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集、杀虫剂标准品及其他分析试剂

2018年8月底至9月上旬，在吉林省和辽宁省10个县市的26个榛园进行样品的采集。分布于吉林省的采样地点包括6个县市：蛟河(N=2)、白山(N=2)、永吉(N=1)、舒兰(N=1)、桦甸(N=2)、通化市(N=2)。分布于辽宁省的采样地点包括4个县市：开原(N=13)、绥中(N=1)、西丰(N=1)、辽阳(N=1)。N表示在采样地N个榛园采集榛子果实、叶片和土壤样品。共采集榛子果实(榛仁和榛壳)样品26个，叶片和土壤样品各21个。其中开原4个榛园、辽阳1个榛园未取叶片和土壤样品。在采样榛园中随机选取20棵榛树作为一组混合采集果实和叶片样品，混合后各取2.0 kg与1.0 kg以上，各采样点准备3组平行样品；自榛树树冠垂直投影区域土地深度约为20 cm以内采集土壤样品，混合均匀后取1.0 kg以上，各采样点准备3组平行样品。采集样品运送至实验室后，于-20 ℃冰箱储存备用。

从北京坛墨质检科技有限公司采购19种杀虫剂标准品，其中，有机磷类杀虫剂标准品9种，包括敌敌畏、乐果、二嗪磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、丙溴磷、哒螨灵；有机氯类杀虫剂标准品2种，包括六氯化苯(六六六)和五氯硝基苯；除虫菊酯类杀虫剂标准品8种，包括氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、联苯菊酯、甲氰菊酯、氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、氯氰菊酯和醚菊酯。用丙酮作为溶剂，配制单个杀虫剂标准品储备溶液，质量浓度为100 mg/L，置于-20 ℃条件下贮存。用丙酮或正己烷作为溶剂，配制系列含有杀虫剂混标稀释液，每种杀虫剂标准品质量浓度为10 mg/L。德国Merck气相色谱级丙酮和正己烷购自青岛天泽生物技术有限公司。氯化钠分析纯购自中国医药集团有限公司(国药集团)。

1.2 杀虫剂残留提取与纯化

1.2.1 果实、叶片样品中杀虫剂残留的提取纯化

①果仁、果壳、叶片样品用粉碎机粉碎成粉末，将30 g粉碎后的样品与70 mL乙腈充分混合振荡2 min。②将萃取溶剂过滤至含有7 g氯化钠的100 mL量筒中，震荡萃取10 min。分层后取上层25 mL乙腈相，转置旋转真空蒸发仪(水浴温度40 ℃)蒸发至接近干燥。浓缩液过微孔滤膜(孔径0.45 μm)去杂质，用丙酮将提取物定容至2 mL，用于分析有机磷杀虫剂(OPs)残留。③取20 mL乙腈相至50 mL烧瓶中，旋转真空蒸发仪(水浴温度40 ℃)蒸发至接近干燥，用正己烷将提取物重新定容至2 mL。用5 mL 10%丙酮/正己烷活化Florisil SPE柱，5 mL正己烷淋洗后，纯化上述2 mL提取液，用5 mL 10%丙酮/正己烷冲洗烧瓶后淋洗柱子两次，混合液转置旋转真空蒸发仪(水浴温度40 ℃)蒸发至接近干燥，浓缩液过微孔滤膜(孔径0.45 μm)去杂，并用正己烷定容至2 mL，用于分析有机氯杀虫剂(OCs)和除虫菊酯(PYs)。

1.2.2 土壤样品中杀虫剂残留的提取纯化

取土壤样品30 g，用60目(孔径0.25 mm)筛网过筛去杂，然后与甲醇和丙酮(体积比为1∶1)充分震荡混合。将样品进行纯化后，用于分析有机磷(OPs)杀虫剂残留，以及有机氯杀虫剂(OCs)和除虫菊酯(PYs)。

1.3 气相色谱-质谱联用仪分析

仪器分析参数设置参考食品安全国家标准GB 23200.9—2016《粮谷中475种农药及相关化学品残留量的测定：气相色谱-质谱法》的测试条件[14]。测试仪器为Clarus 680 GC气相色谱-质谱联用仪(珀金埃尔默公司，美国)；色谱柱为DB-1701石英毛细管柱(30 m×250 μm)，色谱柱温度程序为：初始温度40 ℃，保持1 min，然后以30 ℃/min程序升温至130 ℃，再以5 ℃/min程序升温至250 ℃，再以10 ℃/min升温至300 ℃，保持5 min。载气为氦气，纯度 ≥ 99.999%，流速1.5 mL/min。进样口温度290 ℃,进样量1 μL,进样方式：无分流进样，1.5 min后打开分流阀和隔垫吹扫阀。电子轰击源70 eV，离子源温度230 ℃，GC-MS接口温度280 ℃。选择离子监测：每种化合物选择一个定量离子，2～3个定性离子。每组所有检测成分按照出峰顺序，分时段分别检测。

1.4 杀虫剂残留的定量限、回收率和检出限

本研究中用到的19种杀虫剂标准品CAS号、定量限(LOQ)、回收率和检出限(LOD)详见表1。

表1 19种杀虫剂标准品的CAS号、定量限、回收率和检出限Table 1 The CAS number,LOQ,recovery rate and LOD of 19 pesticide standards

用外标曲线法对杀虫剂残留进行定量。为了避免干扰和污染，每4～5个样品为一批次，每批次设置1个空白对照，该对照除没有添加样品外，其他提取与纯化程序与待测样品的程序完全相同，确认杀虫剂残留定量的准确性(3次生物学重复定量结果的相对标准误差小于10%，表明测定重复性好，并取其均值)。为确保杀虫剂残留量定量的准确性，每天用标准溶液对气质联用仪进行校准。检测器线性响应区间内建立校准曲线进行杀虫剂残留的定量，峰面积与质量浓度的相关性良好(R2>0.99)。检出限是回收率分析的最低添加浓度，本研究中目标杀虫剂残留的LODs范围为0.1～11.1 μg/kg。定量限定义为产生峰值信噪比为10的杀虫剂标准品的最低浓度。

1.5 膳食摄入风险评估

根据估计短期摄入量(estimated short-term intake,记为ESTI)和急性参考剂量(acute reference dose,记为ARfD)，计算急性危害指数(acute/short-term consumer health risk,记为aHI)。依据前期急性膳食摄入风险评估研究，当aHI≤100%时，表示风险可以接受；当aHI>100%时，表示存在急性中毒风险[15-16]。根据估计每日摄入量(estimated daily intake,记为EDI)和每日允许摄入量(acceptable daily intake,记为ADI)计算危害指数(hazard quotient,记为HQ)，即长期摄入健康风险(chronic/long-term consumer health risk)。当HQ≤100%时，表示风险可以接受；当HQ>100%时，表示存在长期累积中毒风险。且aHI和HQ数值越大，表明风险越大[16-17]。为统一计算标准，ARfD和ADI按60 kg人体日摄入量的百分比进行计算，且为评估消费者每日摄入残留杀虫剂健康风险，ARfD和ADI对照基准数值获取自JMPR(Joint FAO/WHO Meeting on Pesticide Residues)[18]。相关公式如下：

ESTI=αmax×min/m；

aHI=ESTI/ARfD×100%；

EDI=αm×min/m；

HQ=EDI/ADI×100%。

式中：ESTI为短期摄入量，mg/(kg·d)；αmax为最高残留水平，mg/kg；αm为平均残留水平，mg/kg；min为食品摄入量，kg/d；m为体质量(成人按60 kg计)，kg；ARfD为急性参考剂量，mg/(kg·d)；EDI为每日摄入量，mg/kg；ADI为每日允许摄入量，mg/kg。

累积危害指数(cumulative hazard index,IcH)表示消费者食用的含多种杀虫剂残留食品的HQ之和，其计算公式为：IcH=∑HQ。

2 结果与分析

2.1 有机磷杀虫剂残留

对采集于辽宁、吉林省10个地点26个生物及土壤样品的有机磷残留水平进行检测，结果如表2所示。

表2 化学防治榛园中有机磷残留分析Table 2 The analysis of OPs residues in chemical controlled hazel orchards mg/kg

在采样点共检测了9种有机磷杀虫剂，在所有样品中共检出了敌敌畏、乐果、二嗪磷、杀螟硫磷、马拉硫磷、毒死蜱、对硫磷、丙溴磷等8种杀虫剂。榛仁作为食用部位，对其中的有机磷残留水平进行了重点关注，共检出8种有机磷杀虫剂，且有2种杀虫剂残留超过最高残留限量(maximum residue limits,MRL)[14,17]，包括：敌敌畏和杀螟硫磷，其最高含量分别为1.140 3和0.905 2 mg/kg，高于MRL值；在26份检测样品中，有2份样品检出敌敌畏成分，有1份样品残留水平超过MRL；有3份样品检出杀螟硫磷成分，有1份样品残留水平超过MRL值。与果仁样品类似，果壳中共检出8种有机磷杀虫剂，其中有3种杀虫剂残留超过MRL值，包括：敌敌畏、乐果和杀螟硫磷，其最高含量分别为1.443 6、0.735 8和2.020 8 mg/kg，均高于MRL值。叶片中共检测到2种有机磷杀虫剂，共有2种杀虫剂残留超过MRL值，包括敌敌畏和杀螟硫磷。在榛园土壤中，共检出敌敌畏、乐果、二嗪磷、杀螟硫磷、马拉硫磷和丙溴磷等6种杀虫剂，其最高值均远超MRL。以上研究表明，化学防治榛园土壤中残留的有机磷杀虫剂种类多、残留量大；叶片中有残留和超MRL的有机磷杀虫剂主要是敌敌畏和马拉硫磷；相对于土壤与叶片，榛仁与果壳中检出的有机磷杀虫剂种类最多，在榛仁中超MRL的有机磷杀虫剂主要是敌敌畏和杀螟硫磷。

2.2 有机氯杀虫剂残留

本研究中共检测了2种有机氯杀虫剂在土壤、叶片、果壳与果仁中的残留量，结果如表3所示。26份果仁样品中，有2份样品检出了六六六，其残留水平低于MRL值。果壳中检出了六六六和五氯硝基苯，其最高残留水平均超过了MRL值。叶片中未检出六六六和五氯硝基苯成分。土壤中检出了六六六残留，其最高残留水平均超过了MRL值。

表3 化学防治榛园中有机氯残留分析Table 3 The analysis of OCs residues in chemical controlled hazel orchards mg/kg

2.3 除虫菊酯类杀虫剂残留

本研究共检测了8种除虫菊酯类杀虫剂在土壤、叶片、果壳与果仁中的残留量，结果如表4所示。在果仁、果壳、叶片和土壤中，分别检出了4、5、2和4种。在榛仁中有2种杀虫剂残留超过MRL值，分别为氟氰戊菊酯和氯氟氰菊酯，其最高含量分别为1.247 6和1.469 2 mg/kg；果仁样品中有4份样品检出氟氰戊菊酯，有1份样品残留氟氰戊菊酯含量超过MRL值，有6份样品检出氯氟氰菊酯成分，有5份样品残留氯氟氰菊酯成分超过MRL值。在果壳中有3种杀虫剂残留超过MRL值，分别为氟氰戊菊酯、氯氟氰菊酯和氯氰菊酯，其最高含量分别为1.741 5、2.085 2和2.683 0 mg/kg。在叶片中有2种杀虫剂残留超过MRL值，包括氟氰戊菊酯和氯氰菊酯。在土壤中有3种杀虫剂残留超过MRL值，分别为氟氰戊菊酯、氯氟氰菊酯和氯氰菊酯。综上所述，在生物与土壤样品中，共检出5种除虫菊酯类杀虫剂残留；其中，榛仁中的氟氰戊菊酯和氯氟氰菊酯的最高残留水平高于MRL值；在果壳、叶片和土壤样品中，氟氰戊菊酯、氯氟氰菊酯和氯氰菊酯的最高残留水平多高于MRL值。

表4 化学防治榛园中除虫菊酯类杀虫剂残留分析结果Table 4 The analysis of PYs residues in chemical controlled hazel orchards mg/kg

2.4 健康风险评估

依据2014年在粮农组织/世卫组织杀虫剂残留问题联席会议中提出的杀虫剂急性参考剂量和每日允许摄入量值[16]，结合各个榛仁样品中杀虫剂的残留水平，对消费食用榛仁的短期和长期健康风险进行评估，结果如表5所示。在短期健康风险评估中，敌敌畏、杀螟硫磷、氯氟氰菊酯和氟氰戊菊酯等4种杀虫剂估计短期摄入量较高，具有潜在的短期健康风险。其中，氯氟氰菊酯急性危害指数最高，达到2.45%，其次为杀螟硫磷(0.75%)和敌敌畏(0.71%),但均远低于100%[15]。目前还没有氟氰戊菊酯的急性参考剂量，其急性危害指数无法计算。其他15种杀虫剂残留较低或未检出，其急性危害指数远小于1%。在长期健康风险评估中，共有敌敌畏、杀螟硫磷和氯氟氰菊酯等3种杀虫剂估计每日摄入量较高，以上3种杀虫剂的危害系数分别为5.50%、1.73%和1.47%。9种有机磷杀虫剂、2种有机氯类杀虫剂和8种除虫菊酯类杀虫剂累积危害分别为7.98%、0.08%、2.07%，因此，有机氯类杀虫剂的累积危害最高，其次为除虫菊酯类杀虫剂。

表5 通过食用榛仁平均每日摄入杀虫剂的短期和长期风险Table 5 The short-term and long-term risks due to average daily intake of pesticides through nut consumption

3 讨 论

本研究对采集于辽宁、吉林省10个地区的26个榛仁样品、26个榛壳样品、21个榛叶样品、21个榛园土壤样品中的19种杀虫剂残留水平进行了检测。主要从最大残留限量、慢性膳食摄入风险、急性膳食摄入风险和累积风险评估方面对榛子质量安全性进行综合评估，与国际该领域主流研究方法相一致[19]。在26个榛仁样品中，共检出13种化学杀虫剂，分别有1个样品敌敌畏残留超出MRL值，有1个样品杀螟硫磷残留超出MRL值，有1个样品氟氰戊菊酯残留超出MRL值，有5个样品氯氟氰菊酯残留超出MRL值；26个榛壳样品杀虫剂残留检测结果显示，从其中7个样品中共检出15种化学杀虫剂，其中敌敌畏、乐果、杀螟硫磷、六六六、五氯硝基苯、氟氰戊菊酯、氯氟氰菊酯、氯氰菊酯在不同样品中残留情况不同，但残留值超出MRL值；在21个叶片样品中，共检出15种化学杀虫剂，其中敌敌畏、马拉硫磷、氟氰戊菊酯和氯氰菊酯4种化学杀虫剂分别在2、1、1和2个样品中残留超出MRL值；在21个榛园土壤样品中，9个土壤样品检测出化学杀虫剂残留，且共检出11种化学杀虫剂，其中只有醚菊酯残留水平未超出MRL值。可见，在榛仁中氯氟氰菊酯超标最为常见，其超标率达到19.23%，敌敌畏、杀螟硫磷和氟氰戊菊酯残留超标率均为3.85%。采样区域榛园化学防治频繁导致果仁、果壳、叶片及土壤中出现多种杀虫剂残留，且检测结果表明杀虫剂在榛壳、叶片中可直接接触组织材料的残存种类和残存程度更高，这也与实际生产相一致。该结果将为后续榛园中杀虫剂的合理使用提供一定理论借鉴。农田、果园等土壤中残留较多杀虫剂，这些残留的杀虫剂易对某些非目标生物产生毒性。由于这些残留累积在土壤的最上层，因此很容易因空气流动而在空气中进行传播，其对环境、榛园微生物群落等的影响还有待进一步的评估。

为评估人体摄入残留杀虫剂的健康风险，本研究对不同种类杀虫剂长期累积危害指数估算发现，有机磷杀虫剂、有机氯类杀虫剂和除虫菊酯类杀虫剂累积危害分别仅为7.98%、0.08%、2.07%，均远远小于100%；同时，榛子作为一种重要的食用坚果，其榛仁是食用主体，过多的杀虫剂残留会对人身健康造成威胁，但本次所检测榛仁样品中所有杀虫剂其急性危害指数和累积危害指数均远低于100%，以上结果表明榛仁的急性摄入风险及长期摄入累积风险均较低。另外，中国营养学会推荐每日食用50 g坚果，榛子出仁率在40%左右，大约等同于每天食用20 g的榛仁[20]，因此推荐的每日摄入量对人的累积风险很低。需要指出的是，随着技术的进步，越来越多的新型杀虫剂会涌现，且目前国内人工榛园面积在快速增长过程中，对产量和质量的要求也越来越高，应该加强对新型杀虫剂等农药名录以及使用方式的更新和管理，重视不同种类农药所产生协同累积摄入风险的评估。本研究中部分杀虫剂并未官方公布相应参考值，无法对其急性或累积风险进行评估，这将是后续需持续关注研究的内容。