多重处理对华重楼种子休眠解除的影响

谭秋生，章文伟，徐 广，邓才富，任星宇，罗 敏，杨永东，罗 川

(重庆市药物种植研究所 中药材质量控制研究中心，重庆 408435)

全世界共有24种重楼植物品种，我国有19种[1]。云南重楼ParispolyphyllaSmith var.yunnanensis(Franch.) Hand.-Mazz.和七叶一枝花(华重楼)ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara为名贵中药材重楼的正品来源[2]。因其生长缓慢，自种子育苗到药材采收至少需要7～10年，加上种植技术薄弱、市场需求量大等原因，供需矛盾十分突出，不仅价格攀高，野生资源也遭受掠夺式采挖，面临枯竭。人工种植是缓解供需矛盾和保护野生资源的重要途径，种子育苗更是大面积种植的重要种苗来源，因其具有品种易控、繁育量大和成本较低等优点。

采取合理措施打破休眠是重楼种子快速育苗的关键。重楼植物在果实成熟时种子的胚发育不全，胚芽、胚轴、胚根和子叶都还未形成，外加胚乳坚硬、内种皮表层角质化等原因，其种子存在形态后熟和生理休眠特性，需要经过胚的形态建成和种子内源抑制物解除两个过程才能萌发[3-6]。研究表明，滇重楼种子内种皮与胚乳不存在吸水障碍[7-8]，外种皮及胚乳均含有抑制种子萌发及幼苗生长的物质，胚乳抑制作用强于外种皮[8-10]，种子种胚休眠解除是抑制物质(ABA)减少与促萌物质(GA3)增加和积累的结果[11]。

赤霉素(GA3)是重楼种子休眠解除研究最常用的一种激素，效果也较好，可能与影响种子中α、β淀粉酶加速淀粉降解促进可溶性糖积累有关[12]，浸种浓度一般50～500 mg·L-1。10%硫酸浸泡重楼种子可软化内种皮，提高萌发率[13]。合适的超声波处理可缩短重楼种子萌发时间，提高发芽率和发芽指数[14-15]。目前，未见稀硫酸、GA3和超声波三者联合处理对重楼种子休眠解除的相关报道。本试验采用10%硫酸首浸+超声+ GA3再浸模式强化华重楼种子层积前处理，恒温沙藏后定期观察种子萌发情况，对各种处理后的休眠破除效果进行评价，筛选最佳处理组合，为华重楼种子快速育苗提供技术支持。

1 材料与试剂

1.1 仪器

AL-104电子天平(梅特勒-托利多仪器公司)；LRHS-150-Ⅱ恒温恒湿培养箱(上海龙跃仪器设备有限公司)；KQ3200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TW12通用水浴槽(德国JULABO)；240 mL组培玻璃瓶。

1.2 试剂

95%赤霉素(GA3，河南新雨化工科技有限公司)；50%多菌灵可湿性粉剂(四川润尔科技有限公司)；硫酸、无水乙醇、氯化汞(分析纯)；纯水，实验室自制。

1.3 材料

试验种子于2018年10月29日购买自四川省万源市玉带乡曹家山村，经本单位章文伟副研究员鉴定为七叶一枝花ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara的带新鲜红色外种皮种子。试验前，种子加水40 ℃浸泡48 h，然后在不锈钢筛网上，反复用手搓揉种子和加水清洗，除净红色外种皮，得白色净种子，以下简称白籽，阴干，过圆孔筛(Φ3 mm)，收集筛面上表面光亮、子粒饱满种子，备用。

2 方法

2.1 种子准备

备足50 mL小烧杯，每杯随机计量数入100粒白籽，每种处理设置3个重复。

2.2 首浸

除对照(CK)外，每杯加入10%硫酸20 mL，分别室温浸泡10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，倒出硫酸废液，种子加水2次透洗。

2.3 超声

包括对照(CK)，每杯加水30 mL，置超声波清洗器中，保持水温40 ℃，超声(150 W、40 kHz)50 min，倒出种子沥干后装回原杯。

2.4 再浸

除对照(CK)用纯水外，每杯加入100 mg·L-1、200 mg·L-1、300 mg·L-1、400 mg·L-1和500 mg·L-1GA3溶液20 mL，用保鲜膜封口，置于水浴槽中25 ℃、避光浸泡24 h，倒出赤霉素废液，种子加水2次透洗后倒出沥干。

2.5 层积湿沙制备

干河沙过筛，收集直径0.5 mm下的细沙粒，130 ℃干热灭菌4 h，冷却后，加入沙量2%的50%多菌灵粉剂，拌匀，按30%～40%含水量加水，搅匀。河沙湿度控制在“手握成团，轻捏即散”的状态，即可。

2.6 装瓶和沙藏

取上述复合处理后的干白籽，用75%酒精浸泡1 min、再用0.15% HgCl2浸泡10 min，纯水透洗3次，沥干后，与50 g湿沙拌匀后装入玻璃组培瓶中，确认种子都被沙覆盖后，旋紧盖子，放入20 ℃培养箱避光培养。

2.7 数据统计与分析

本研究将种子露白，胚根突破种皮1 mm视为萌发。试验4个月，分别于54 d、82 d和110 d共3次对沙藏种子进行集中观察，选出已萌发种子，清除腐烂种子，按萌发率(%)=萌发种子累计数/试验种子数×100%计算各期萌发率，数据经Microsoft Excel 2010处理后用SPSS 21.0软件进行方差分析，两两比较采用S-N-K检验。

3 结果与分析

3.1 不同浓度GA3浸种对华重楼种子萌发的影响

华重楼白籽直接加水超声后再用不同浓度GA3浸泡后沙藏，各期萌发率见表1。先后3次观察，均以400 mg·L-1GA3(简称N400，下同)组最佳，萌发率最高，分别为39.00%、41.00%和80.00%，与其他浓度组均有显著差异。前两次，只有N400超过CK，分别超出1.33%、9.33%，差异较小；第3次，N400和N100均超过CK，分别超过45.33%、30.66%，差异较大。赤霉素浸泡对华重楼种子休眠解除有一定作用，但无明显影响规律。试验表明，华重楼种子超声+GA3浸泡模式中，最佳GA3浓度为400 mg·L-1，其次为100 mg·L-1，种子萌发速度及萌发率均较高，萌发率分别为80.00%和65.33%。

表1 华重楼种子不同浓度GA3浸泡后萌发率

3.2 10%硫酸不同时间浸种对华重楼种子萌发的影响

华重楼白籽用10%硫酸浸泡不同时间后再加水超声后沙藏，各期萌发率见表2。先后3次过程观察，均以50 min(简称M50，下同)组最佳，萌发率最高，分别为40.00%、77.33%和85.33%。第1次，仅有M50超出CK 12.33%，M40与CK相近；第2次，M20、M40和M50分别超出CK 28.33%、33.66%和45.66%；第3次，M10、M20、M40和M50分别超出CK 27.33%、30%、46.33%和50.66%。第1、2次，M50与其他时间组均有显著差异；第3次，M50与除M40外的时间组有显著差异。10%硫酸浸泡对华重楼种子休眠解除有一定作用，但也无明显影响规律。试验表明，华重楼种子10%硫酸浸泡+超声模式中，最佳浸泡时间为50 min，其次为40 min，种子萌发速度及萌发率均较高，萌发率可达到80.00%以上。

表2 华重楼种子用10%硫酸浸泡不同时间萌发率

3.3 10%硫酸、超声波与GA3联合处理对华重楼种子萌发的影响

华重楼白籽经10%硫酸不同时间浸泡、超声和不同浓度赤霉素(GA3)浸泡后沙藏，第3次(110 d)种子萌发率见表3。仅有M10+超声+N400萌发率超过90.00%；萌发率80%～90%有6组，分别为M20+超声+N400、M40+超声+N400、M40+超声+N300、M10+超声+N100、M40+超声+N100和M30+超声+N400。三组最差，萌发率<10%，分别为M10+超声+N200、M20+超声+N100和M20+超声+N300。表明10%硫酸+超声+GA3模式可有效解除华重楼种子休眠，提高萌发率，最佳组合为M10+超声+N400，其次为M30+超声+N400。GA3浓度、10%硫酸浸泡时间分别以400 mg·L-1和40 min为宜。

表3 不同组合处理后沙藏种子萌发率

方差分析结果(表4)显示：10%硫酸(min)，F=171.834，P<0.01，差异极显著；GA3(mg·L-1)，F=442.240，P<0.01，差异极显著；10%硫酸(min)*GA3(mg·L-1)，F=160.915，P<0.01，差异极显著。表明去除红外种皮华重楼种子层积前处理时10%硫酸浸泡时间和GA3浓度对其休眠解除后萌发影响都极显著。10%硫酸浸泡40 min、50 min效果较好，与CK、浸泡10 min、20 min和30 mim均有显著差异(表5)；GA3浸泡以400 mg·L-1浓度最佳，与其他浓度组有显著差异(表6)。相关性分析结果(表7)表明10%硫酸浸泡时间与种子萌发率呈极显著正相关，GA3浸泡浓度与种子萌发率呈负相关，影响不显著。

表4 10%硫酸联合GA3浸泡后萌发率的方差分析结果

表5 10%硫酸不同时间浸泡萌发率均数的两两比较 (S-N-K法)

表6 不同浓度GA3浸泡萌发率均数的两两比较 (S-N-K法)

表7 10%硫酸浸种时间与GA3浸种浓度对种子萌发率的相关性分析

4 讨论

相同超声条件下，10%硫酸或GA3浸泡对华重楼种子休眠解除、促进萌发均有一定作用，但无明确影响规律。单因素考察，10%硫酸最佳浸泡时间为50 min、其次为40 min，GA3浸泡最佳浓度为400 mg·L-1，萌发率均可达到80%及以上。10%硫酸、超声和GA3联合处理，6种组合种子萌发率均可达80%以上，以10%硫酸10 min+超声+400 mg·L-1GA3组合萌发效果最好，萌发率高达96.67%。10%硫酸浸泡时间和GA3浓度对去皮华重楼种子萌发都有极显著影响，10%硫酸浸泡时间与萌发率呈极显著正相关，GA3浓度与萌发率呈负相关，但影响不显著。本试验只对20 ℃恒温层积效果进行了评价，文献多主张高低变温层积，通过这种强化前处理的组合措施，变温试验是否会取得更好效果，还有待进一步研究。

本研究主要考虑到重楼种子具有内种皮表层角质化、胚乳坚硬且含萌发抑制物等特点，在现有文献[13，16-17]的基础上，以强化前期处理尽量缩短种子层积时间为目标，分别选用10%硫酸浸种软化种皮提高种子透水性、40 ℃超声(150 W、40 kHz)50 min置换种子抑制萌发物和赤霉素溶液25 ℃再浸种24 h增加促萌物质。试验用华重楼白籽百粒重4.5 g左右，其生活力采用0.1%TTC染色法[18]测定为92.0%。

项目组还对GA3拌湿河沙层积效果进行了考察，具体方法为华重楼白籽10%硫酸浸泡20 min+超声+水浸泡处理后埋藏于不同浓度GA3拌湿河沙中层积。结果表明，随GA3浓度增加对华重楼种子萌发表现一定抑制作用，最宜100 mg·L-1，萌发率90.53%；相同浓度GA3，拌湿河沙层积效果优于再浸种。原因可能有二：①用水替换GA3再浸种可置换出更多抑萌物质；②GA3拌沙，沙中GA3含量较高和残留更持久，种子长时间被GA3包围，作用更充分，从而影响其萌发。赤霉素拌沙层积技术对后续种子发芽出苗及生长有何影响，以及是否适合推广都还有待进一步研究。