响应面法生产青钱柳老叶保健酒的工艺优化

谢 洪，陆步诗，伍 强，李新社，王婧璇

（1.邵阳学院食品与化学工程学院，湖南邵阳 422000；2.生态酿酒技术与应用湖南省重点实验室，湖南邵阳 422000）

青钱柳又名“铜钱树”或“摇钱树”，为胡桃科青钱柳属植物，该属仅有青钱柳一种，是集绿化、保健、药用于一体的珍稀树种[1]。其中含有的成分主要有无机类、黄酮类、多糖类和三萜类。无机类成分包括铁、铜、锌等[2]；黄酮类包括黄酮醇及其苷类化合物[3-4]等；多糖类包括糖醛酸、β-糖苷键，并且有少量多糖和蛋白结合[5]；三萜类包括阿江榄仁酸、青钱柳酸A 和青钱柳酸B 等[6]。根据相关研究表明，青钱柳具有降血糖[7-9]、降血脂[10-14]、降血压[15]等功效。其中，青钱柳叶中含有的黄酮类物质通过对胰岛细胞[16]产生作用，从而改善糖脂代谢紊乱[17]。目前，关于青钱柳的利用，主要有将其嫩叶制作成茶叶、茶酒、饮料等，其老叶总黄酮类物质含量比嫩叶中的高，但利用率低，甚至任其自然腐化，是一种严重的资源浪费。

关于青钱柳中总黄酮的提取研究报道，目前主要以乙醇为溶剂，采用超声波辅助进行提取，主要有：蒋南洋[18]利用超声辅助提取，其总黄酮得率为6.9134 %；董安强[19]利用超声辅助提取，其总黄酮得率为2.95 %；吴茹[20]利用超声辅助提取，其总黄酮得率为8.427%。但有关青钱柳保健酒的生产技术及工艺未见有报道。因此，利用青钱柳老叶生产保健酒能为青钱柳的深度利用与加工探索新途径，能为保健酒市场提供新品种，有着资源优化与环保的双重意义。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原料：青钱柳老叶，武冈青钱柳有限公司提供。

酒样：62%vol 二锅头白酒，北京顺鑫农业股份有限公司。

试剂及耗材：芦丁标准品，安徽酷尔生物工程有限公司；NaNO2（分析纯），天津市永大化学试剂有限公司；Al(NO3)3·9H2O（分析纯），成都金山化学试剂有限公司。

仪器与设备：倾斜式高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；电热恒温水浴锅，北京中兴伟业世纪仪器有限公司；UV-2600 紫外可见分光光度计，岛津仪器苏州有限公司；高速离心机，长沙东旺实验仪器有限公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；电子式液体密度计，石家庄市百亨通用仪器仪表制造有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程

试验采用的工艺流程如下：

操作要点：

（1）粉碎：取青钱柳老叶，粉碎后40目过筛。

（2）浸泡：样品在一定的酒精度、液料比、时间和温度下进行水浴，并且在此过程中需将锥形瓶用封口膜进行密封，防止水浴过程造成酒中成分挥发。

（3）离心：取一定量样液进行高速离心，首先进行粗离心（转速800 r/min，常温离心5 min），然后取上清液，再进行高速离心（转速为6000 r/min，温度4 ℃下15 min），取上清液待测。

（4）检测：取上清液进行总黄酮含量的测定。为避免色素对检测结果的影响，需要进行Black 实验，Black实验组为不加亚硝酸钠溶液。

1.2.2 单因素试验

在其他因子不变的条件下，将浸泡酒精度分别设定为20%vol、30%vol、40%vol、50%vol、60%vol；液料比（v/w）分别设定为60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1；浸提温度分别设定为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃；浸提时间分别设定为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 进行单因素试验，每组试验作3 个平行样，通过检测青钱柳老叶保健酒中总黄酮含量并计算其得率，确定各因素较适宜水平。

1.2.3 响应面试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken 中心组合设计原理，进行响应面优化试验设计，以酒精度（alcohol content，A）、时间（time，B）、液料比（liquid-material ratio，C）、温度（temperature，D）为影响因素，青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率（yield）为指标设计试验。

1.3 总黄酮含量测定方法

准确配制1.0 mg/mL 芦丁标准液，5 %亚硝酸钠溶液，10%硝酸铝溶液，4%氢氧化钠溶液。精确吸取0 mL、0.125 mL、0.250 mL、0.500 mL、1.0 mL、2.0 mL、4.0 mL 于1—7 号10 mL 具塞试管中，待用。在1—7 号中先加入1 mL 60 %乙醇，再加入5 %亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，放置10 min，再加入10 %硝酸铝溶液0.3 mL，摇匀，放置10 min，再加入4 %氢氧化钠溶液4 mL，并用60 %乙醇定容至10 mL，摇匀，并放置15 min。1 号管为对照组[20]。经过扫描吸收光谱，得到反应后样品在502 nm 处有最大吸收峰。因此选择502 nm 作为测定波长。用1 号试管调零，随后对2—7 号试管进行3 次测定，记录吸光度，取得平均值；以芦丁浓度（X）对吸光度（Y）作图，回归方程为Y=5.281X-0.0134（R2=0.999）；将样品按上述方法进行测定，得出吸光度。并根据回归方程，得出总黄酮的含量，并计算总黄酮得率W（%）。公式如下：

式中：m1——在工作曲线上算出试样溶液的总黄酮，mg；

V——试样的提取体积，mL；

V1——测定时吸取试样的体积，mL；

M——青钱柳老叶质量，g。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 酒精度对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响

在液料比80 mL/g、时间40 min、温度60 ℃时，探究不同酒精度（20 %vol、30 %vol、40 %vol、50 %vol、60 %vol）对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响。结果见图1。

图1 酒精度对青钱柳总黄酮得率的影响

由图1 可以看出，随着浸泡酒精度的变化，总黄酮得率呈现先上升后下降的情况，当酒精度达到50 %vol 时，总黄酮得率最大，继续增加酒精度，则总黄酮得率不增反降。原因是因为青钱柳中的黄酮类物质，部分易溶于水，部分易溶于乙醇等有机溶剂。试验中，当酒精度达到50%vol时，总黄酮得率达到了比较适宜的溶点，故选取酒精度为50%vol作为较适宜的浸泡酒精度。

2.1.2 时间对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响

在液料比80 mL/g、温度60 ℃、酒精度50%vol时，探究不同时间（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响。结果见图2。

图2 时间对青钱柳总黄酮得率的影响

由图2 可看出，随着浸泡时间的变化，总黄酮得率呈现先上升后下降的情况，当时间达到30 min时，总黄酮得率最大。原因是浸泡前期，总黄酮的浸出率大于氧化速率，随着浸泡时间延长，部分黄酮出现氧化现象。故选取浸泡时间30 min 作为较适宜的浸泡时间。

2.1.3 液料比对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响

在酒精度50%vol、时间30 min、温度60 ℃时，探究不同液料比（v/w）（60∶1、70∶1、80∶1、90∶1、100∶1）对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响。结果见图3。

图3 液料比对青钱柳总黄酮得率的影响

由图3 可以看出，随着浸泡液料比变化，总黄酮得率呈现先上升后下降的现象。推断为随着溶剂量增加，黄酮类物质浸出增加。当液料比达到90 mL/g 时，溶出率达最大，随后继续增加液料比时，总黄酮溶出率不变，但其他物质反而逐步增大，影响了总黄酮得率，使总黄酮得率变小。故选取液料比90 mL/g作为较适宜的浸泡液料比。

2.1.4 温度对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响

在酒精度50%vol、时间30 min、液料比90 mL/g时，探究不同温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃）对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响。结果见图4。

图4 温度对青钱柳总黄酮得率的影响

由图4 可以看出，随着浸泡温度的变化，总黄酮得率呈现先上升后下降的情况，浸泡时，温度达到80 ℃时，误差范围变大。原因是随着浸泡温度升高，黄酮浸出率增加，但当温度达到80 ℃时，总黄酮得率下降且误差范围突然增大的原因可能是温度升高的同时也提高了黄酮的氧化速度，且酒精沸点为78 ℃，白酒部分挥发，导致试验过程中总黄酮得率发生变化。故选取70 ℃作为较适宜的浸泡温度。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 响应面试验设计与结果

在单因素试验结果基础上，采用4 因素3 水平进行响应面分析，研究各个因素对青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响的最佳组合。试验设计及结果见表1、表2。

表1 响应面设计的因素与水平

2.2.2 响应面试验方差分析

通过统计分析软件Design Expert 11 对表2 中的数据进行多元回归拟合分析，建立了回归模型，并获得总黄酮得率（W）的二次多项回归方程：

表2 响应面的设计方案及试验结果

W=2.64+0.0225A+0.0125B+0.025C+0.05D-0.04AB-0.025AC+0.0025AD+0.0025BC-0.025BD-0.0525CD-0.1272A²-0.0422B²-0.0684C²-0.0184D²

由表3 可知，回归模型的F 值为10.0824（P＜0.0001），表明该模型极显著；液料比C、温度D、酒精度-时间AB、液料比-温度CD、时间的二次项B2、液料比C2的P 值均小于0.05，说明对青钱柳总黄酮得率有显著的影响；酒精度A2的P 值小于0.0001 说明对青钱柳总黄酮得率有极显著的影响；其他因素的P 值大于0.05，说明无显著影响；失拟项F=2.1587，P=0.2385＞0.05，表明失拟项差异不显著；模拟的判定系数（R2=0.9098），表明有90.98 %的数据可以用这个方程来较好的反映总黄酮得率的变化；模型的调整相关系数R2Adj=0.8195，说明拟合模型方程较为可靠；变异系数CV=1.44 %，说明仅有总变异的1.44%不能用此模型来解释，模型的精密值为10.2781＞4，因此该回归模型与实验数据拟合程度较高，误差范围较小，故可以用此模型进行工艺条件预测和分析。根据图表分析，得出了4个因素对浸泡过程中青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的影响程度为：温度（D）＞液料比（C）＞酒精度（A）＞时间（B）。

表3 响应面对总黄酮得率的方差分析

2.2.3 响应面试验交互作用分析

根据响应面实验设计的原理，三维响应面图弯曲度越大，表明两因素之间的显著性差异越显著，由此反应各因素的交互作用对总黄酮得率的影响。等高线变化趋势可知道各试验因素最优条件下的取值，响应曲面在模型中底面的投影为等高线图，其形状反映出白酒浸泡青钱柳老叶试验过程中两两因素交互之间的效果，其表现为圆形表明两因素间对总黄酮得率效果影响不显著，表现为椭圆形表示两因素交互影响显著，响应面图及等高线如图5所示。

由图5 可以看出，在浸泡过程中，在酒精度和时间两因素作用下，总黄酮得率存在极大值点，表现为随着浸泡青钱柳老叶酒精度数和时间的提高，总黄酮得率呈现先升高而后降低的趋势，两因素间的交互作用显著且酒精度的显著程度较时间明显；在酒精度与液料比两因素中，液料比对总黄酮得率的影响较酒精度显著，这与方差分析的结果一致，等高线表明酒精度和液料比交互作用不明显，其中液料比对总黄酮得率比酒精度影响大；酒精度和温度两因素对总黄酮得率影响不显著，其中酒精度对总黄酮得率的影响较温度不明显，等高线表明两因素间对总黄酮得率的影响并不是简单的线性关系，原因可能是因为酒精度对青钱柳总黄酮提取程度不同，而温度影响总黄酮的提取和氧化速率；在时间和液料比两因素作用下，青钱柳浸泡酒中总黄酮存在极大值，但交互作用不明显；在时间和温度两因素影响下，总黄酮得率的变化趋势并不明显，但温度对总黄酮得率的影响较时间显著，且等高线表明两因素之间的交互作用显著；在液料比与温度响应面与等高线图中，液料比与温度对青钱柳浸泡酒中总黄酮得率的影响显著，随着液料比与温度的升高，总黄酮得率均呈现升高或下降的趋势，等高线表明液料比和温度两因素总黄酮得率的影响具有显著性差异，这与方差分析结果一致。因此，在生产过程中，应该特别注意控制浸泡时的温度，温度过高会对黄酮类物质产生较大的影响，同时也可能会导致白酒中的部分成分挥发，从而影响白酒本身的风味物质。

2.2.4 验证实验

图5 各因素之间的交互作用三维图及等高线

由软件Design Expert 11分析得出浸提过程中，总黄酮得率的最佳条件为：酒精度58 %vol、时间24 min、液料比86 mL/g、温度80 ℃，模型预测值为2.618%，为了进一步验证该方法的可行性，对此工艺条件进行3 次重复试验，得到总黄酮的实际得率为2.608%（3次结果取平均值），实际测得值与模型预测值相比，相对误差为3.8%，说明本实验建立的二次多项回归方程能有效的反映各因素对浸泡过程中总黄酮得率的影响，同时也验证了用响应面优化青钱柳老叶保健酒中总黄酮得率的回归方程模型是可行的。

3 结论

目前，关于白酒浸提青钱柳老叶中总黄酮得率的研究报到较少，本文在试验过程中，单因素实验结果表明，在浸泡过程中，总黄酮得率的较适宜条件为：酒精度50%vol、时间30 min、液料比90 mL/g，温度70 ℃时。但考虑到各个因素之间可能存在交互作用，故进行了响应面试验，以此进行各条件的优化。根据试验结果表明，在浸泡过程中，温度和液料比对总黄酮得率的影响最大，酒精度的影响次之，时间的影响最小。并根据响应面试验优化，得到总黄酮得率的最佳条件为：酒精度58%vol、时间24 min、液料比86 mL/g、温度80 ℃。在此条件下青钱柳总黄酮提取量为2.618 %，在青钱柳老叶保健酒中总黄酮的含量为0.304 mg/mL。