HIF- 2α 对自噬介导的肝癌细胞顺铂耐药的影响及机制

戴启强 杜学锋 王爱东 章文龙

肝癌早期症状较隐匿、病情进展快、治疗难度大且预后较差，是一种常见的恶性肿瘤，我国肝癌发病率及死亡率均居世界首位，在消化系统肿瘤死亡率中居第3位[1]。肝癌具有早期远处转移特点，目前治疗主要以顺铂（cisplatin）等常规化疗药物为主，但易产生化疗耐药，造成肿瘤复发，最终导致患者死亡[2-3]。肿瘤细胞耐药机制较为复杂，研究发现缺氧微环境是影响恶性肿瘤预后的重要因素，也可能是肿瘤细胞化疗耐药的始动因素[4]。低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）可上调与肿瘤化疗耐药有关的基因表达，其功能主要取决于α 亚基，主要分为HIF-1α 和HIF-2α 两种亚型[5]。HIF-2α 是肿瘤细胞应对局部缺氧等微环境发生适应性反应的重要调节因子，在多种肿瘤生长、转移及耐药过程中发挥重要作用[6]。目前大多数研究都致力于HIF-2α 对乳腺癌、肝癌等癌细胞增殖、凋亡及侵袭影响的研究，而关于HIF-2α 对人肝癌阿霉素耐药细胞株（HepG2/ADM）耐药的研究较少，且与自噬的关系也不清楚。因此，本研究探究HIF-2α 对自噬介导的肝癌细胞HepG2/ADM cisplatin耐药的影响及机制，以期为疾病的临床治疗提供新思路。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 RPMI1640 培养基（批号：XY-183-02165）、FBS（批号：XY-M-M6546）均购自上海熹垣生物科技有限公司；青霉素/链霉素（批号：S17032）购自上海源叶生物科技有限公司；CCK-8 试剂盒（批号：KTC011001）购自武汉艾美捷科技有限公司；微管相关蛋白1 轻链3-Ⅱ（microtubule associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）抗体（批号：18725-1-AP）购自美国Proteintech 公司；cisplatin（批号：IC0440）购自上海恒斐生物科技有限公司；自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）（批号：T2191a）、转染试剂盒（批号：SL100688）均购自上海经科化学科技有限公司；Beclin 1 抗体（批号：SPC-600S）、辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔IgG 抗体（批号：SPC-5110） 均购自加拿大StressMarq 公司；缺氧诱导因子-2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）抗体（批号：BS90635）、β-actin 抗体（批号：BM6017）均购自武汉益普生物科技有限公司；PDVF 膜（批号：70335-90）购自北京海德创业生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒（批号：R40014）、BCA 蛋白检测试剂盒（批号：R21250）均购自上海源叶生物科技有限公司；膜联蛋白V-异硫氰酸酯/碘化丙啶（annexinv-fluoresceine isothiocyanate/propidium iodide，AnnexinV-FITC/PI）细胞凋亡双染试剂盒（批号：556547）购自上海复申生物科技有限公司。RT-60000 型酶标仪购自上海信裕生物科技有限公司；GelDocEZ 型全自动蛋白凝胶成像仪购自美国Bio-Red公司；DxFLEX 型流式细胞仪购自上海莫瑞生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞与培养 人肝癌细胞HepG2 和HepG2/ADM 均购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所，-80 ℃冰箱取出后37 ℃溶解，1 000 r/min 离心5 min，弃去上清液，再添加含10%FBS、100 U/ml 青霉素-链霉素的RPMI1640 培养基，培养条件为37 ℃、饱和湿度、5%CO2。HepG2/ADM 细胞在培养过程中加1 μg/ml cisplatin 以维持其顺铂耐药性。

1.2.2 实验分组与处理 将两种肝癌细胞分为以下各组：（1）HIF-2α-siRNA＋cisplatin 组：HepG2/ADM 细胞转染HIF-2α-siRNA 后加入终浓度5 μmol/L 的cisplatin；（2）HIF-2α-siRNA 组：HepG2/ADM 细胞转染HIF-2αsiRNA；（3）NC-siRNA 组：HepG2/ADM 细胞转染空载体；（4）3-MA＋cisplatin 组：HepG2/ADM 细胞贴壁后加入终浓度为5 mmol/L 的3-MA 和cisplatin；（5）cisplatin组：HepG2、HepG2/ADM 细胞贴壁后加入终浓度5 μmol/L 的cisplatin；（6）3-MA 组：HepG2/ADM 细胞贴壁后加入终浓度为5 mmol/L 的3-MA；（7）对照组：HepG2、HepG2/ADM 细胞不作任何处理，于37 ℃、5% CO2培养箱中正常培养。siRNA 转染参照转染试剂盒说明书进行操作，HIF-2α-siRNA 干扰序列：5'-TGAAAACGAGTCCGAAGCC-3' 和5'-GTGGCTGACTTGAGGTTGA-3'，引物由上海生工生物公司合成。

1.2.3 各组细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平检测 采用Western blot 法。将HIF-2α-siRNA 组、NC-siRNA 组、cisplatin 组、3-MA 组、对照组细胞培养24 h 后，收集各组细胞，吸除培养液后用PBS 洗涤3次，加入0.1 ml 预冷的RIPA 裂解液，冰浴30 min，4 ℃、10 000 r/min 离心30 min，吸取上清液蛋白。采用BCA法测定细胞蛋白总浓度。加样缓冲液与蛋白样品等体积混合，沸水煮10 min。采用10% SDS-PAGE 电泳，电泳完成后转移至PDVF 膜上，封闭液室温封闭2 h，加LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α、β-actin 抗体（1∶1 000 稀释）作为一抗，4℃孵育过夜，次日TBST 洗膜3 次后加入HRP 标记的羊抗兔IgG（1∶2 500 稀释）作为二抗，室温孵育2 h，ECL 显色，Kodak 胶片曝光。采用Gel-Proanalyzer 图像分析系统对蛋白表达水平进行定量分析。

1.2.4 各组细胞凋亡率检测 将HIF-2α-siRNA＋cisplatin 组、HIF-2α-siRNA 组、NC-siRNA 组、3-MA＋cisplatin 组、cisplatin 组、3-MA 组、对照组细胞培养24 h后，根据AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡双染试剂盒说明书操作：各组细胞经PBS 溶液洗涤2 次后收集细胞，Binding Buffer 悬浮细胞，加入100 μl 含AnnexinV-FITC和PI 的缓冲液中，混合后室温避光下孵育20 min，最后于流式细胞仪中测定细胞凋亡率。

1.2.5 各组细胞增殖抑制率检测 按1×104个/孔的密度将处于对数生长期的转染HIF-2α-siRNA HepG2/ADM 细胞接种于96 孔板，每组设置3 个重复孔，过夜培养，待贴壁后加入终浓度为1.25、2.5、5、7.5、10 μmol/L的cisplatin，放置于37 ℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱内培养24 h，培养结束后按CCK-8 试剂盒说明书操作进行计数，用酶标仪检测450 nm 处吸光值（A），根据公式计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组A/对照组A）×100%。

1.3 统计学处理 采用SPSS 23.0 统计软件。计量资料以表示，两组间比较采用两独立样本t 检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平比较

2.1.1 cisplatin 组和对照组HepG2、HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平比较 cisplatin 组HepG2、HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平较对照组均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平较HepG2 细胞均显著升高，差异均有统计学意义（均P＜0.05），见图1、表1。

图1 cisplatin 组和对照组HepG2、HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达电泳图（HepG2/ADM 为人肝癌阿霉素耐药细胞株；LC3-Ⅱ为微管相关蛋白1 轻链3-Ⅱ；HIF 为低氧诱导因子）

2.1.2 3-MA 组和对照组、HIF-2α-siRNA 组和NCsiRNA 组HepG2/ADM 细胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达水平比较 3-MA 组HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达水平较对照组均显著下降（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA 组HepG2/ADM 细胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达水平较NC-siRNA组均显著下降（均P＜0.05）。见图2、表2。

2.2 各组细胞凋亡率比较

2.2.1 cisplatin 组和对照组HepG2、HepG2/ADM 细胞凋亡率比较 cisplatin 组HepG2、HepG2/ADM 细胞凋亡率较对照组均显著升高（均P＜0.05）；cisplatin 组HepG2/ADM 细胞凋亡率较HepG2 细胞显著降低（P＜0.05），见表3。

2.2.2 各组HepG2/ADM 细胞凋亡率比较 3-MA＋cisplatin 组HepG2/ADM 细胞凋亡率较cisplatin 组、3-MA 组和对照组均显著升高（均P＜0.05），cisplatin 组HepG2/ADM 细胞凋亡率较3-MA 组和对照组均显著升高（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA＋cisplatin 组HepG2/ADM 细胞凋亡率较HIF-2α-siRNA 组、NC-siRNA 组和cisplatin 组均显著升高（均P＜0.05）；HIF-2α-siRNA 组和NC-siRNA 组HepG2/ADM 细胞凋亡率较cisplatin组均显著降低（均P＜0.05），见表4。

表1 cisplatin 组和对照组HepG2、HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平比较

图2 4 组HepG2/ADM 细胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达电泳图（HepG2/ADM 为人肝癌阿霉素耐药细胞株；HIF 为低氧诱导因子；LC3-Ⅱ为微管相关蛋白1 轻链3-Ⅱ）

表2 4 组HepG2/ADM 细胞中HIF-2α、LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达水平比较

表3 cisplatin 组和对照组HepG2、HepG2/ADM 细胞凋亡率比较（%）

2.3 各浓度组细胞增殖抑制率比较 沉默HIF-2α 表达后，随cisplatin 处理浓度增加，HepG2/ADM 细胞增殖抑制率升高，见表5。

3 讨论

肝癌发病迅速、流行性广、生存率低，致死率仅次于肺癌和胃癌，居恶性肿瘤第3 位，严重威胁人类健康。cisplatin 是肝癌治疗中疗效较好的一种化疗药物，为许多肝癌患者带来了希望。然而目前为止，化疗过程中产生的肝癌细胞耐药性是影响化疗失败的主要因素[7-8]。因此，如何控制肝癌细胞cisplatin 耐药的发生，提高药物敏感性及治疗效果，是近年来人们关注的热点问题。局部缺氧是肿瘤发生耐药性的重要机制之一，介导肿瘤细胞对缺氧耐受最重要的因子是HIF，而cisplatin 能够抑制肿瘤血管生成，进一步促进肿瘤缺氧发生，此机制可能是肝癌细胞产生cisplatin 耐药，进而影响其疗效的重要原因[9-10]。因此，HIF 可能与肝癌细胞耐药有密切联系。

表4 各组HepG2/ADM 细胞凋亡率比较（%）

表5 各浓度组细胞增殖抑制率比较（%）

HIF-α 是HIF 蛋白的调节和活性亚基，在多种肿瘤生长及耐药中发挥重要作用[11-12]。HIF-2α 是细胞氧信号途径中的关键转录调节因子，与恶性肿瘤的预后密切相关[13]。自噬在癌症化疗中既能保护耐药细胞又能促进耐药细胞死亡，与肿瘤分期、肿瘤类型、肿瘤微环境及治疗方案等密切相关[14]。诱导肿瘤细胞衰老和凋亡可减少化疗药物剂量、有效提高肿瘤治疗效果、减少化疗不良反应，因此cisplatin 是促进癌细胞衰老、凋亡的有效化疗药物[15]。杨书才等[16]通过Western blot 等方法研究HIF-2α 对肝癌化疗耐药性的影响及机制，证明HIF-2α 可通过上调LRP、MDR1 等耐药基因的表达从而增加肝癌细胞的耐药性。李春男等[17]通过检测肝细胞生成素Cn（hepatopoietin Cn，HPPCn）对肝癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，最终证明HIF-2α 参与索拉非尼耐药的发生，HPPCn 沉默通过抑制HIF-2α 来影响缺氧诱导的肝癌细胞索拉非尼耐药。本研究结果显示，cisplatin 处理HepG2、HepG2/ADM 细胞后，细胞凋亡率均显著升高，且HepG2/ADM 细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1、HIF-2α 蛋白表达水平较HepG2 细胞升高，提示HepG2/ADM 细胞的自噬水平及HIF-2α 蛋白表达水平均较高；同时研究发现，cisplatin 可能导致HepG2、HepG2/ADM 肝癌细胞凋亡率及自噬水平升高的同时，亦会导致HIF-2α 蛋白表达上调。进一步研究发现，3-MA 处理HepG2/ADM 细胞24 h 后，细胞中LC3-Ⅱ、Beclin 1 蛋白表达水平均下降，提示3-MA 处理导致HepG2/ADM 细胞的自噬水平受到抑制。而3-MA＋cisplatin 组HepG2/ADM 细胞凋亡率显著高于cisplatin 组，提示抑制自噬可有效提高HepG2/ADM 细胞的cisplatin 敏感性，同时推测诱导自噬可能在HepG2/ADM 细胞中起到抵抗cisplatin 损伤的作用，进而保护癌细胞；再进一步研究发现，siRNA 可同时抑制HIF-2α 蛋白和细胞自噬蛋白的表达水平；沉默HIF-2α 表达后，随cisplatin 处理浓度增加，HepG2/ADM 细胞增殖抑制率升高，提示抑制自噬可能对HepG2/ADM细胞的cisplatin 敏感性有一定影响，同时推测诱导自噬可能在HepG2/ADM 细胞中起到抵抗cisplatin 损伤的作用，进而保护癌细胞。

综上所述，本研究采用HIF-2α-siRNA 抑制HIF-2α 表达后，HepG2/ADM 细胞自噬水平受到抑制、凋亡率显著提高、增殖抑制率显著上升，表明HIF-2α 可有效地提高HepG2/ADM 细胞对cisplatin 的敏感性，下调HIF-2α 表达可能成为增强肿瘤化疗药物疗效的新手段。然而其具体作用机制十分复杂，涉及到多种蛋白，尚需进一步深入研究。