补肾益精方对外周血BMSCs在干性ARMD小鼠中视网膜分化及CNTF表达的影响

许 凯，唐由之，梁丽娜，张 晶，侯 乐，梁 洁，陈 强，马群英

0引言

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是发达国家50岁以上人群不可逆性盲的首位病因，在我国的发病率也呈逐年上升趋势。根据有无视网膜下脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)分为干性ARMD和湿性ARMD。随着对CNV研究的深入，通过药物治疗、激光光凝、光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)及手术等方法，湿性ARMD的治疗已取得较好的临床效果。干性 ARMD由于脂质过氧化物和氧自由基等在视网膜内蓄积，导致视网膜色素上皮 (retinal pigment epithelium，RPE) 细胞凋亡及感光细胞损伤，目前尚无确切的药物疗法[1]。近年来，干细胞研究的快速发展为干性ARMD的治疗带来了潜在的希望。补肾益精方是唐由之研究员治疗干性ARMD的经验方，前期动物实验研究显示该方对干性ARMD小鼠视网膜有一定的保护作用，并可以动员自体骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)向外周血迁移及向视网膜组织归巢[2-3]。基于前期研究结果，本实验观察补肾益精方是否可以促进外周血干细胞向视网膜细胞分化以及视网膜组织中睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)的表达，以进一步明确其作用机制。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组动物选用SPF级健康无眼疾C57BL/6小鼠36只，约6～8周龄，雄性[北京维通利华实验动物技术有限公司提供，生产许可证编号：SCXK(京)2016-0006]。适应性饲养7d后，按随机数字表法选择其中的24只予40mg/kg碘酸钠(NaIO3)尾静脉注射造模，并评定造模情况[3-4]，本研究纳入动物均造模成功。

造模后第1d，尾静脉注射3×106个绿色荧光蛋白标记的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(green fluorescent protein labeled bone marrow-derived mesenchymal stem cells，GFP-BMSCs)，然后随机分为蒸馏水组及补肾益精方组，每组12只。干细胞注射后第1d，补肾益精方组予补肾益精方药液灌胃(8.8g/kg)，每天1次。蒸馏水组每天予等量的蒸馏水灌胃。另选12只健康C57BL/6小鼠常规饲养作为正常组。治疗14d时进行相关指标评价。动物实验程序与福利均符合实验动物伦理学要求。

1.1.2实验试剂及仪器补肾益精方由何首乌、枸杞、黄芪、黄精等组成，煎剂由中国中医科学院眼科医院药学部制备而成，浓度为880g/L。绿色荧光蛋白标记的C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞(GFP-BMSCs)购自Cyagen公司，NaIO3(SIGMA-ALDRICH公司)，Triton-100(北京优尼康生物科技有限公司)，牛血清白蛋白(BSA)(北京元亨圣马生物技术研究所)，Anti-RPE65(ab78036)、Anti-Rhodopsin(ab5417)、Anti-GFAP(ab7260)、Anti-CNTF(ab46172)、Alexa Fluor® 647标记的驴抗小鼠 IgG H&L (ab150107)购自Abcam公司，罗丹明标记山羊抗兔IgG H&L(ZF-0316)购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TaqDNA聚合酶(Amplied Biosystems公司)，Trizol Reagent RNA提取试剂盒(Ambion公司)，M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一链合成试剂盒(Invitrogen公司)，氯仿、异丙醇(北京化工厂)，loading buffer、DNA marker(北京优尼康生物科技有限公司)，CM1850冰冻切片机、DM2500显微镜(德国Leica公司)，激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司)，荧光定量PCR仪(Amplied Biosystem公司)。

1.2方法

1.2.1免疫荧光染色颈椎脱臼法处死小鼠，立即摘除右眼眼球，制作冰冻切片。一抗孵育(Anti-RPE65，1∶500；Anti-Rhodopsin，1∶50；Anti-GFAP，1∶500；Anti-CNTF，1∶500), 4℃过夜；PBST洗涤3次，二抗孵育(Alexa Fluor® 647标记的驴抗小鼠 IgG H&L，1∶500；罗丹明标记山羊抗兔IgG H&L，1∶100)，避光室温孵育2h；PBST洗涤3次，DAPI复染；PBS洗涤，抗荧光衰减封片剂封片，荧光显微镜下观察。计数每个视野中RPE65+、Rhodopsin+、GFAP+细胞(即红色荧光)、GFP+细胞(即绿色荧光)以及RPE65、Rhodopsin、GFAP细胞与GFP双染细胞(即黄色荧光)数量，计算比值[BMSCs分化率(%)=双染阳性细胞数/同视野GFP+细胞数×100%)]，并进行统计分析。

1.2.2实时荧光定量PCR检测颈椎脱臼法处死小鼠，立即摘除左眼眼球，分离出新鲜视网膜，按Trizol Reagent RNA提取试剂盒说明书提取视网膜样本中总RNA。应用M-MLV Reverse Transcriptase cDNA第一链合成试剂盒逆转录合成cDNA，紫外分光光度计测定其浓度。以β-actin为内参，引物基因序列如下：CNTF：F5’-GCTTTCGCAGAGCAATCAC-3’，R5’-AGAGGCCACCATCTCCAAT-3’；β-actin：F5’-ATATCGCTGCGCTGGTCGTC-3’，R5’-AGGATGGCGTGAGGGAGAGC-3’。扩增条件为：95℃ 5min，(95℃ 15s，60℃ 15s，72℃ 15s)×45个循环，分析溶解曲线。采用2-ΔΔct方法进行数据的相对定量分析，ΔΔct=(实验组目的基因平均ct值-实验组内参基因平均ct值)-(对照组目的基因平均ct值-对照组内参基因平均ct值)。统计各组视网膜组织中CNTF mRNA的相对表达量。

2结果

2.1补肾益精方对GFP-BMSCs在视网膜分化的影响RPE细胞特异性抗体RPE65免疫荧光染色发现，正常组RPE细胞排列规整，呈强阳性(红色荧光)染色；蒸馏水组和补肾益精方组RPE65阳性染色减少减弱，细胞排列不规整，可见散在RPE65及GFP双染阳性细胞，两组双染细胞阳性率分别为(12.63±2.69)%、(14.32±5.57)%。虽然补肾益精方组的双染色阳性细胞总数较蒸馏水组多，但阳性率两组差异无统计学意义(P=0.857)，见图1、2。感光细胞特异性抗体Rhodopsin免疫荧光染色发现，正常组Rhodopsin主要在感光细胞外节段表达，呈强阳性(红色荧光)染色；蒸馏水组和补肾益精方组外节段结构紊乱，呈碎片化弱阳性染色，均可见GFP阳性细胞，但在外节段区未发现双染细胞(图3)。胶质细胞特异性抗体GFAP免疫荧光染色发现，正常组GFAP在星形胶质细胞、Müller细胞靠近视网膜神经节细胞(retinal ganglion cells,RGCs)部位有少量表达(红色荧光)；蒸馏水组和补肾益精方组GFAP阳性表达均较正常组增强，可见GFAP、GFP双染阳性细胞。蒸馏水组在神经节细胞层可见较强GFAP阳性染色。补肾益精方组GFAP在神经节细胞层、内丛状层呈垂直视网膜分布的线条状阳性染色，内核层呈细点状染色。补肾益精方组双染细胞阳性率为(30.50±8.10)%，明显高于蒸馏水组(15.65±3.89)%，两组间差异有统计学意义(P<0.01)，见图2、4。

图1 免疫荧光观察各组视网膜RPE65表达情况(×400)。

图2 两组BMSCs分化率比较 bP<0.01 vs 蒸馏水组。

2.2补肾益精方对视网膜CNTF表达的影响

2.2.1免疫荧光检测视网膜中CNTF蛋白表达情况结果发现，正常组CNTF在神经节细胞层表达，呈强阳性(红色荧光)染色。蒸馏水组视网膜中表达较弱，仅在神经节细胞层、内核层有少量阳性细胞。补肾益精方组CNTF阳性表达虽然较正常组弱，但强于蒸馏水组，在神经节细胞层、内核层均可见大量阳性细胞，外核层有少量阳性细胞(图5)。

2.2.2实时定量PCR检测视网膜中CNTF mRNA表达情况三组CNTF mRNA表达比较差异有统计学意义(P<0.01)。蒸馏水组和补肾益精方组视网膜中CNTF mRNA的表达与正常组相比均增加，差异有统计学意义(P=0.047、0.038)。补肾益精方组较蒸馏水组显著增加，差异有统计学意义(P=0.044)，见表1。

图3 免疫荧光观察各组视网膜Rhodopsin表达情况(×400)。

表1 给药14d时各组视网膜CNTF mRNA表达情况

3讨论

本研究选择的动物模型是NaIO3诱导的干性ARMD模型，是目前国内外公认且应用较多的造模方法。研究显示[5]，C57BL/6小鼠在注射NaIO36h后，RPE细胞出现坏死；24h后，感光细胞外节断裂，并出现感光细胞凋亡；3d时，感光细胞凋亡达到高峰；7d时，感光细胞完全凋亡。此模型选择性地引起RPE层损伤，继而导致感光细胞等组织发生病理改变的特性与干性ARMD的发病特点相似。因此，选用该模型进行实验。

对于干性ARMD的治疗，虽然膳食补充剂疗法在一定程度上减缓了疾病的进展，但还未发现其他疗效确切的治疗药物。近年来，细胞替代治疗方法的出现，尤其是干细胞研究的快速发展使干性ARMD的治疗成为可能，并被认为是目前最有应用前景和临床转化潜能的治疗策略之一[6]。尽管既往研究取得了一些成果，但仍存在不少问题，比如移植后视网膜功能改善维持时间短，移植细胞不能很好地整合于宿主细胞及分化成视网膜细胞等，如何解决这些问题是干细胞更好应用于临床的关键。中医学认为，精是人体生命活动的根本物质。“肾者主蛰，封藏之本，精之处也”，肾精充足，则能发挥化生的作用，这与干细胞的理论有相似之处。因此，通过补肾益精方，有可能通过增强自身BMSCs的修复能力，发挥保护视网膜变性损伤的作用。

补肾益精方是唐由之研究员治疗干性ARMD的经验方，该方以制首乌滋补肝肾、填精益髓；枸杞滋养肝肾，益精明目；黄芪补气健脾；黄精补气养阴，健脾益肾，诸药合用，使精血畅达，上注于目，临床上用于治疗视网膜变性疾病。前期我们研究发现补肾益精方可以延缓先天性视网膜变性模型英国皇家外科学院(Royal College of Surgeons，RCS)大鼠视网膜细胞的凋亡[7]，促进外周血干细胞在视网膜的聚集及神经营养因子分泌[8]，另外，补肾益精方对NaIO3诱导的干性ARMD小鼠也有保护作用，并可以促进外周血BMSCs在视网膜归巢[2-3]。归巢后的BMSCs是否能分化为具有功能的视网膜细胞需要进一步探讨。现代药理学研究发现，制首乌可保护神经细胞，并促进神经干细胞向神经元分化[9-10]；枸杞可促进BMSCs向神经元分化，增加海马神经元干细胞的分化速率，促进海马神经元再生，保护神经系统[11-14]；黄芪可促使BMSCs的增殖、动员及向神经细胞分化[15-18]；黄精可促进BMSCs的增殖以及动员因子粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)的表达[19]。本实验结果显示补肾益精方不能促进BMSCs分化为RPE细胞和感光细胞，但是对分化为胶质细胞具有较为明显的促进作用。在生理状态下，胶质细胞起支持、指引神经元迁移、参与血-脑屏障的诱导及形成的作用，同时在维持细胞周围微环境的稳态方面通过分泌多种细胞因子和神经递质，参与激素和神经递质的代谢，并在信号转导和免疫调节等方面具有重要作用，其功能的完整性是正常视功能所必须的[20-22]。在视网膜损伤早期，胶质细胞为保护组织免受进一步损伤，会出现反应性的胶质增多，GFAP表达增加，释放神经营养因子(neurotrophic factors, NTFs)和抗氧化剂，发挥神经保护作用[23-24]。其他研究也发现，无论是体内还是体外培养，MSCs在一定条件下都能分化成神经胶质细胞和神经元，表现出修复神经的功能，呈现向损伤处迁移的特性[25-26]。

图4 免疫荧光观察各组视网膜GFAP表达情况(×400)。

目前认为MSCs修复视网膜变性损伤的机制一方面在趋化因子介导下，迁移至损伤部位，并跨胚层分化为视网膜细胞，直接替代坏死或凋亡的细胞[27-31]；另一方面通过旁分泌作用产生CNTF、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、碱性成纤维细胞生长因子 (basic fibroblast growth factor，bFGF)等NTFs以及抗凋亡相关因子等，使其在受损视网膜的微环境中表达上调，促进视网膜修复[32-35]。CNTF作为视网膜保护中被研究最多的神经营养因子之一，主要由胶质细胞和神经所支配的组织产生，对视网膜神经元具有明显的保护作用[36-38]，研究表明，CNTF能增加外核层厚度，减少感光细胞凋亡，提高感光细胞的存活能力，延缓疾病发展[39-43]。并且可以显著增强信号传导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)的磷酸化，调节感光细胞对光子的传导性，保护视网膜细胞[44]。因此，本实验观察了补肾益精方对CNTF在视网膜表达的影响，结果发现补肾益精方组CNTF mRNA和蛋白的表达量较蒸馏水组均增加，提示补肾益精方可以促进CNTF的表达。另有研究发现，在中枢神经系统，胶质细胞在受损伤早期可以分泌CNTF。当中枢神经受损时，CNTF从胶质细胞中释放，并在损伤区域周围聚集[20,45]。在本实验中，由于CNTF mRNA和蛋白表达量趋势与胶质细胞特征性标志物GFAP相一致，因此我们认为补肾益精方一方面促进视网膜本身CNTF表达增加，另外也可能通过促进分化的胶质细胞释放CNTF，保护受损视网膜。

图5 免疫荧光观察各组视网膜CNTF表达情况(×400)。

综上所述，通过本实验我们发现补肾益精方能够促进BMSCs在干性ARMD小鼠模型视网膜分化为胶质细胞，并促进视网膜CNTF的表达，这可能是补肾益精方保护视网膜变性损伤的作用机制。