多表位流感纳米粒构建表达及验证

李 凯，于 潼，于成东，于 宁，庄忻雨，汪 伟，陈振海，田明尧*，金宁一* (1.扬州大学 兽医学院，江苏 扬州 5100；.军事医学研究院 军事兽医研究所,吉林 长春 1301)

流感病毒是正黏病毒科的成员，正黏病毒科是一组包膜病毒，其中包含分段的负义单链RNA基因组。3种主要类型的流感病毒(A、B和C)感染人类，其中甲型和乙型流感病毒每年引起大量发病和死亡[1]。因此，具有广谱抗流感的疫苗亟待研发[2]。

血凝素(HA)是流感的主要抗原，它在免疫过程中，诱导中和抗体的产生。虽然HA蛋白结构高度变异，但其第二亚基(HA2)形成相对保守的颈部结构域，在病毒感染早期阶段起重要作用[3]。M2e是甲型流感病毒的跨膜区，自1993年以来，它的序列在人类分离物中几乎没有变化，并且与动物源性菌株进行对比，只有几个氨基酸不同[4]。许多基于M2e候选疫苗产生特异性体液免疫以抵挡甲型流感的攻击[5]，M2e和HA2结合的蛋白质疫苗是开发广谱流感疫苗的一个有效途径[6-7]。然而，M2e和HA2本身免疫原性就很差，刺激机体产生较少的多肽抗体[8]。这些抗原与高度免疫原性佐剂或蛋白载体融合可增强其免疫原性[8-9],最有希望提高免疫原性的是铁蛋白纳米颗粒，在抗原递呈中起着至关重要的作用[10]。本试验按照大肠杆菌偏爱密码子对序列M2e-HA2-Ferrtin进行优化并合成，以pGH-T-M2e-HA2-Ferrtin为模板，扩增目的片段并克隆至原核表达载体pET32a，表达纯化出流感多表位重组蛋白，为广谱流感疫苗的研制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料T4DNA连接酶购自美国NEB公司；Mouse Anti-6X His tag®antibody和Goat Anti-Mouse IgG H&L(HRP)、His标签蛋白纯化试剂盒(可溶性蛋白)购自康为公司；克隆感受态细胞Trans1-T1、IPTG和表达感受态细胞BL21(DE3)与Blue Plus®Protein Marker均购自北京全式金公司；限制性内切酶与DNA Mark购自日本TaKaRa公司；原核表达载体pET32a由本室保存；引物和基因合成由吉林省库美生物科技有限公司完成。

1.2 引物设计与合成M2e和H1、H3、B亚型HA2保守区域通过4GSLinker与铁蛋白连接，M2e-HA2-Ferrtin按照大肠杆菌密码子优化由吉林省库美生物科技有限公司合成并克隆至pGH-T载体上。利用Primer5.0设计1对特异性引物，由吉林省库美生物科技有限公司合成。引物PGH-pet-32a-MHF-F：GAATTCGATATTTGGACCTATA-ATGCAGAACT；pGH-pet32a-MHF-R：AAGCT-TGCTTTCATTATCACTATCACCTAAGG。下划线部分为EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位点。

1.3 M2e-HA2-Ferrtin基因扩增、纯化及酶切以合成的pGH-T-M2e-HA2-Ferrtin为模板扩增M2e-HA2-Ferrtin基因PCR体系(50 μL)：PrimeSTAR Max Premix(2×)25 μL，模板1 μL，上、下游引物各1 μL，加水补至50 μL。PCR反应程序：98℃预变性3 min；98℃变性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸45 s，共33个循环；72℃下再延伸10 min，16℃ 30 min停止。取3 μL PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照，剩余产物进行PCR纯化，纯化后经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，酶切产物进行胶回收。置-20℃保存备用。

1.4 重组质粒的构建及酶切鉴定空载体pET32a热转化克隆感受态细胞Trans1-T1，涂布于含有氨苄青霉素(100 mg/L)的LB平板上培养12 h。挑取单个菌接于含氨苄青霉素的LB液体培养基扩培，提取质粒，用EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切。经1%琼脂糖电泳后，切胶回收。回收的载体pET32a和目的片段M2e-HA2-Ferrtin过夜连接；热转化后，涂板。挑取单个菌于含氨苄青霉素的LB培养基扩培，提质粒，进行双酶切鉴定并测序。测序由吉林省库美生物科技有限公司完成。

1.5 重组蛋白的诱导表达将构建的重组质粒热转化表达感受态细胞BL21(DE3)，重组菌涂于含氨苄青霉素的LB平板。挑取单个菌落于5 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的LB液体培养基，37℃、220 r/min，过夜培养。取培养的菌液接2YT(含氨苄抗生素)培养基中于摇床培养，加入终浓度为1 mmol/L IPTG 20 μL,220 r/min、37℃、8 h。诱导菌液经12 000 r/min、4℃离心6 min，弃上清，用预冷PBS重悬菌体，离心。将沉淀重悬于PBS中，于冰上超声破碎。样品煮沸后进行SDS-PAGE 检测。

1.6 重组蛋白纯化条件摸索将含有目的蛋白的溶液，取上清过平衡的层析柱，用20、50、100、200、300、500 mmol/L咪唑的缓冲液洗脱。收集洗脱液。经SDS-PAGE检测纯化效果。

1.7 Western blot 检测重组蛋白免疫学活性蛋白经SDS-PAGE后转膜，用5%脱脂乳封闭1 h；分别加入鼠源His单抗作为一抗，过夜孵育，用TBST洗3次，10 min/次。加入羊抗鼠IgG-HRP(二抗)，室温孵育1 h，洗涤后，均匀滴加ECL显色液进行显色并拍照。

1.8 重组蛋白透射电镜观察取50 μL蛋白样与透射电镜专用铜网共孵育5 min，1%磷钨酸负染3 min，滤纸吸去多余染液，通过(透射电子显微镜transmission electron microscope，TEM)观察蛋白结构。重复样品3次，避免试验误差。

1.9 重组蛋白纳米粒度仪分析打开纳米粒度仪，预热20 min左右，比色皿中加入3 mL的去离子水，取20 μL样品加入四面光滑的比色皿中,进行样品测试。

2 结果

2.1 pET32a-M2e-HA2-Ferrtin原核表达载体的构建EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切重组质粒pET32a-rHF可见1 071 bp大小的M2e-HA2-Ferrtin(图1)和5 900 bp载体片段(图2)。

M.DL5000 DNA Marker;1.MHF基因扩增产物

M.DL5000 DNA Marker;1.重组质粒pET-32a-MHF;2.EcoRⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒

2.2 重组流感蛋白的表达纯化设置对照组空载体pET32a，重组流感蛋白组进行蛋白诱导，流感蛋白主要以可溶形式存在，相对分子质量约61 kDa(图3)，蛋白纯化后蛋白纯度可达80%(图4)。

M.蛋白Marker;1.pET32a空载体全菌;2.pET32a空载体超声破碎沉淀;3.pET32a空载体超声破碎上清;4.pET32a-MHF全菌;5.pET32a-MHF超声破碎沉淀;6.pET32a-MHF超声破碎上清

M.蛋白Marker;1.20 mmol/L咪唑;2.50 mmol/L咪唑;3.100 mmol/L咪唑;4.200 mmol/L咪唑;5.300 mmol/L咪唑;6.400 mmol/L咪唑;7.500 mmol/L咪唑

2.3 重组蛋白纯化条件摸索为了最大化的去除杂蛋白，通过20、50、100、200、300、500 mmol/L咪唑的缓冲液梯度洗脱目的蛋白。最终成功确定20 mmol/L 咪唑洗涤，300 mmol/L洗脱目的蛋白(图5)。

M.蛋白Marker;1.纯化的pET32a-MHF;2.未纯化的pET32a-MHF

2.4 重组蛋白免疫学活性以重组蛋白为抗原，分别以Antibody-his mouse 为一抗。HRP羊抗鼠IgG为二抗进行Western blot。在61 kDa出现目的条带(图6)。与预期结果一致，表明重组流感蛋白具有生物学活性。

M.蛋白Marker;1.pET-32a-MHF重组蛋白与相应抗体反应条带;2.pET-32a空载体对照

2.5 重组蛋白纳米电镜分析通过电子透射显微镜观察重组流感蛋白，呈现类病毒样颗粒的结构(图7)，大小均一，20～70 nm占78%以上。

图7 透射电子显微镜下重组流感蛋白

2.6 纳米粒度仪分析纳米粒大小通过纳米粒度仪分析重组蛋白粒径大小(图8)，大部分流感纳米粒径分布为12～67 nm，平均粒径61.58 nm。

图8 纳米粒度仪分析重组蛋白纳米粒大小

3 讨论

流感病毒血清型众多，抗原易突变，能够感染人和动物。每年都有许多人死于季节性流感[11]。据世界卫生组织统计，全球流感患病人数高达10亿，其中有300万～500万比较严重的病例，每年死亡人数高达30万～50万。近年来，流感病毒的跨种传播成为新的变异趋势[12]。

半个多世纪以来，针对各种流感病毒引起广泛交叉保护的流感疫苗一直是一项科学挑战[11]。针对流感蛋白中保守的表位以产生特异性免疫，只要适当呈现这些表位，如保守的HA茎区域和M2e就有可能发展成为通用流感疫苗[12-13]。蛋白质外壳结构，例如病毒衣壳和铁蛋白，是适用于遗传和化学修饰的多功能纳米级平台[14]。通过多功能纳米级平台来提高抗原的免疫原性是一种有效的方法[15]。因此，基于Ferrtin基因共表达流感的保守序列的蛋白对流感病毒的防治具有重大意义。

本研究通过大肠杆菌系统成功表达基于铁蛋白的重组流感融合蛋白，通过镍柱纯化及摸索蛋白洗涤、洗脱浓度，成功纯化出目的蛋白，蛋白以可溶性形式存在，纯度高达80%,纳米粒度仪表明平均粒径61.58 nm。通过透射电子显微镜观察，可以看到类似于病毒样颗粒的结构，大大提高了抗原性。为广谱流感亚单位疫苗的研发奠定理论基础。