参与P-gp 膜定位和功能调控的相关蛋白研究进展

吴桐，刘晓东

（中国药科大学药学院药物代谢研究中心，江苏 南京 210009）

ATP 结合盒（ATP-binding cassette，ABC）转运体是一种包含多种跨膜转运体的转运蛋白家族合称，在包括磷脂、固醇、胆汁酸、肽类及各种药物在内的多种底物跨膜运输中起到重要作用。这些转运体通过和ATP 结合后水解产生的能量，将特异性底物逆浓度梯度泵送到细胞外侧。在人类中共鉴定出49 种ABC 转运蛋白，并将其分为7 组（ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG）。P-gp（P-glycoprotein）作为ABC家族的成员之一，最早发现主要表达于多药耐药（multidrug resistance，MDR）细胞中；近来发现在肠上皮细胞、肝脏、肾小管上皮细胞和脑血管内皮细胞中均有表达。P-gp 主要功能是通过介导外源化合物的外排转运来保护这些器官，但同时也阻碍肠道内药物吸收及药物向脑内分布。P-gp 被认为是参与包括胰腺癌和白血病在内的多种癌细胞MDR 现象的重要转运体[1-2]。

针对P-gp 在疾病发生和治疗过程中的重要作用以及P-gp 功能和表达的调控因素已有广泛研究。其中包括维拉帕米（verapami）、环孢素A（cyclosporin A）、长春新碱（vincristine）等在内的P-gp 抑制剂，通过改变ATP 水解酶活性、竞争性占据结合位点等方式抑制P-gp 的功能，但也存在着和其他药物相互作用诱导毒性的风险[3]。先前笔者所在课题组的研究结果证实，在大鼠肝性脑病疾病模型中，体内胆红素和血氨等特异性物质升高引发的炎症及氧化应激反应，将会激活包括核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）和细胞外蛋白调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinases 1 and 2，ERK1/2）等信号通路，对P-gp 的功能和表达起调控作用[4-5]。糖尿病状态下肝脏内P-gp 表达会升高，肠道内的P-gp 表达将会下降[6]。P-gp 主要在细胞膜上发挥功能，mRNA 水平翻译之后，通过ERM（ezrin/radixin/moesin）蛋白家族锚定在膜上，其中脂筏（lipid raft）区域在P-gp 转运通道的形成中起重要作用，微囊蛋白-1（caveolin-1，Cav-1）定位于小窝（caveolae），作为脂筏上一种重要蛋白成分，与P-gp 结合调节其结构和功能（见图1）。本文将围绕P-gp 在膜上的定位与转运过程，阐释相关蛋白对于P-gp 膜上的功能和表达的调控作用。

图1 ERM 及caveolin-1 对P-gp 在膜上的定位和功能调控机制Figure 1 Regulation of ERM and caveolin-1 on P-gp location and function on cell membrane

1 P-gp 转运体

P-gp 最早在中国仓鼠卵巢细胞中发现，因其具有阻止细胞毒性药物进入细胞的功能，将其命名为通透性糖蛋白（permeability glycoprotein，P-gp）。P-gp是一个相对分子质量为170 000 的ABC 转运蛋白，由1 280 个氨基酸组成，是一种由人类MDR1基因编码的能量依赖性药物外排转运体。人P-gp 由2 个对称的氨基N-末端和羧基C-末端盒式结构组成，具有43%的相似性，并且每个盒式结构均包括6 个跨膜段，其上带有ATP 结合基团。P-gp 先与ATP结合再水解，通过这一过程释放能量，来达到转运的目的[7-9]。

P-gp 高表达通常见于一些富集转运体的组织处引发的肿瘤，例如胰腺癌、结肠癌、肝癌、肾上腺癌和肾癌[1,10]，通常在卵巢、乳腺和食道及胃的肿瘤中观察到低水平的P-gp 表达[11-12]，然而在例如肺癌和淋巴瘤的化疗过程中会升高P-gp 的表达水平，从而导致MDR 发展[13-14]。在正常组织中，P-gp 也有表达，并且发挥着特殊的生理作用。在肝脏中，P-gp表达在肝细胞胆管侧膜，在肾脏中P-gp 主要位于近曲小管的上皮细胞的腔侧面。由于P-gp 在肝脏和肾脏的特殊位置，促进药物从肝细胞侧排向胆管或从肾小管上皮细胞外排至尿液，参与药物胆汁排泄和肾清除过程[15]。结肠和空肠的上皮细胞腔侧面表达有P-gp，具有限制口服药物吸收进入血液的作用，这成为口服药物生物利用度低的重要原因之一[16]。P-gp 也高表达于脑微血管内皮细胞的腔侧膜上，其功能是防止毒素和药物进入脑内，成为中枢神经系统的“守门人”[17-18]。

2 ERM 蛋白对P-gp 的作用

2.1 ERM 蛋白家族

ERM 蛋白家族由埃兹（ezrin，Ezr）蛋白、根（radixin，Rdx）蛋白和膜突（moesin，Msn）蛋白3 种相似蛋白组成，集中于富含肌动蛋白的细胞表面，在细胞骨架和细胞膜之间起连接作用。ERM 由包含300 个氨基酸残基的FERM（erythrocyte band four point one Ezrin-Radixin-Moesin）结构域和约200 个氨基酸残基组成的中段α-螺旋区域及100 个氨基酸残基构成的C-末端构成。在细胞膜结构中，ERM 氨基端FERM 和C-末端分别与质膜和肌球蛋白位点结合，在细胞的黏附、形态构建和质膜功能蛋白质的定位过程中发挥重要作用[19-20]。

2.2 ERM 蛋白对P-gp 膜定位和转导的调控作用

通常用P-gp 的mRNA 水平作为判断其活性的指标，但一些研究显示P-gp 的mRNA 水平并不总与其活性水平相关[19,21-22]。如小肠中P-gp 的mRNA水平，从十二指肠到回肠段呈现增加的趋势。文献报道显示，P-gp 的底物维拉帕米在十二指肠、空肠和回肠段均被吸收，最大外排出现在空肠段[21]。在回肠的上端至中段区域内mRNA 水平呈降低趋势，但在末端达到最高[22]，而P-gp 底物罗丹明123（rhodamine 123，Rho 123）在回肠中段观察到最大外排[19]。

只有定位在细胞质膜（plasma membrane）上P-gp才能显示其外排活性。作为质膜蛋白的连接蛋白，ERM 家族在其调控过程中扮演了重要的角色。有研究显示，在小鼠小肠内P-gp 的mRNA 和蛋白水平从顶端至底部呈现升高的趋势，Rdx 蛋白也呈现相同的趋势。同野生型小鼠相比，Rdx基因敲除小鼠在小肠中下部质膜上P-gp 的表达显著降低，进而影响外排Rho123 作用，其P-gp 的mRNA 水平未见明显改变[23]。在人结肠腺癌细胞 (Caco-2)模型中，沉默Rdx也显著降低细胞膜上P-gp 的表达，但对细胞膜的功能未造成影响。沉默Ezr和Msn并没有影响到细胞膜上P-gp 的表达[24-25]，上述结果提示在小肠上主要由Rdx 参与细胞膜上P-gp 的定位调节。

在人体外血脑屏障模型细胞系（hCMEC/D3）中，沉默Rdx也能显著降低P-gp 在膜上的表达；而抑制Msn可降低P-gp 的外排活性，但并没有影响到P-gp 在膜上的分布。沉默Ezr对于P-gp 在膜上的表达和功能均未产生影响，证实在hCMEC/D3 细胞中Ezr 对于P-gp 无调控作用[26-27]。另有文献报道，在吗啡诱导5 d 后小鼠原代脑血管细胞中，Msn 和P-gp 膜蛋白表达均显著升高，其总蛋白水平不变。免疫荧光沉淀也证实Msn 和P-gp 的膜共定位[28]。上述研究结果也证实，在血脑屏障上的P-gp 膜定位受到Rdx 和Msn 的影响，结构上与Msn 存在相关性，Ezr 未对P-gp 产生调控行为。肝脏炎症的大鼠上也发现P-gp 表达随着Rdx 水平的降低而降低[29]。同时有研究证明，在人肝癌细胞系（HepG-2）中，沉默Rdx也导致细胞膜上P-gp 表达减少，总蛋白水平不变，沉默Msn未见类似的改变，而沉默Ezr降低了P-gp 的mRNA 水平。说明在肝细胞膜P-gp 的定位同样和Rdx 有关联，Ezr 在翻译水平上影响了P-gp的表达[30]。肾脏中尚未见P-gp 膜上定位的改变同ERM 蛋白家族调节有关的报道。

上述结果部分验证了ERM 蛋白家族在P-gp 膜定位中作用。P-gp 在翻译后被糖基化，随后被运送至质膜并插入质膜，在质膜中活化的ERM 蛋白与P-gp 连接以稳定其膜定位。因此，ERM 家族蛋白的表达调节将直接影响P-gp 在质膜上的定位，进而影响P-gp 活性。

3 Caveolin-1 蛋白对P-gp 的作用

3.1 脂筏与caveolin-1 蛋白

细胞膜是由胆固醇、磷脂、糖脂和蛋白质构成的磷脂双分子结构，其中蛋白以覆盖、贯穿、嵌入3 种方式和膜连接。脂筏是细胞膜上由鞘脂和胆固醇组成的特殊脂质微区，因为鞘脂包含更长和更多的饱和脂质尾巴，所以鞘脂/胆固醇脂质筏要比周围甘油磷脂组成的膜环境更厚且流动性更差。迄今为止，各种对于脂筏结构的研究将脂筏的结构定义为一种小窝结构，即在细胞膜上呈现烧瓶状内陷，并且被Cav-1 包被[31]。

Cav-1 是小窝主要的膜内在蛋白，其相对分子质量为22 000，其特征是具有异常的发夹状构象，其中N 端和C 端区域均面向细胞质[32]。Cav-1 和许多蛋白质相互作用。在脑部Cav-1 可以通过抑制基质金属蛋白酶对紧密连接蛋白的分解作用来保护血脑屏障的完整性[33]。在肝脏中，Cav-1 作为一种调控蛋白，参与到肝脏的脂质蓄积、葡萄糖代谢和肝细胞生殖等多种生理活动中[34]。Cav-1 还参与到多种调节细胞功能的信号通路环节中。如Cav-1 的下调可激活ERK 信号通路，从而减少了细胞的迁移[35]。

3.2 脂筏上caveolin-1 对P-gp 的调控

P-gp 属于跨膜蛋白，对于所处细胞膜周围的脂质环境非常敏感，P-gp 和脂筏区域有着密切的联系。P-gp 在脂筏区域的表达与细胞系种类和细胞裂解技术有关，并和Cav-1 的表达存在一定的相关性。如在人结肠癌高表达多药耐药蛋白细胞系（HT-29-MDR）和人乳腺癌细胞系（MCF-7/AdrR）中，P-gp在脂筏区域的表达高达38% ～ 40%[36]。在过表达P-gp的AuxB1 细胞和耐药细胞CHRC5 中观察到P-gp 和Cav-1 共定位。在脑肿瘤组织中同样观察到P-gp 位于富含Cav-1 的微囊结构中，P-gp 和Cav-1 共同表达于管腔内皮间室[37]。Cav-1 与P-gp 蛋白共膜定位，Cav-1 与P-gp 相互作用形成了高分子复合物，以此调控P-gp 活性。当小窝结构被抑霉菌素破坏，P-gp的转运活性也受到了影响[38]。这些研究表明P-gp在脂筏区域高度表达，小窝可能是P-gp 发挥外排转运功能的主要区域，其活性也受到该区域的胆固醇和糖脂等多方面因素影响。

目前对于Cav-1 与P-gp 的研究主要集中在脑组织及相关体外模型。在大鼠脑内皮细胞系RBE4 中，小干扰RNA（siRNA）下调Cav-1 的表达后，P-gp底物紫杉醇和长春新碱在RBE4 中的累积分别降低了约38%和40%，这一过程通过降低Cav-1 表达减弱了与P-gp 的相互作用，进而增加P-gp 的转运活性。用酪氨酸激酶处理使得Cav-1 磷酸化后，紫杉醇和长春新碱的累积分别增加了27%和30%。提示Cav-1 的磷酸化增强Cav-1 和P-gp 之间的相互作用，从而抑制了P-gp 的转运功能[39]。另一项研究使用H2O2处理人体外血脑屏障模型hCMEC/D3，在20 min 内显著降低P-gp 外排转运活性，并降低了其在膜上的表达，但总蛋白含量并没有受到影响，这说明P-gp 在膜上的功能和表达受到细胞内部翻译后的调控，氧化应激同样增加了Cav-1 的磷酸化，增强了Cav-1 同P-gp 之间的作用，导致P-gp 外排活性降低，去除氧化应激后，P-gp 的活性恢复[40]。

关于Cav-1 与P-gp 之间的关联在1998 年就被报道[41]。Cav-1 的过表达可诱导细胞膜上胆固醇水平的降低，抑制P-gp 的活性[42]。在人乳腺癌细胞MCF-7/ADR 中，Rack1 受体通过调节Cav-1 磷酸化在不改变P-gp 蛋白水平的条件下调节其转运活性[43]。Abl 和Scr 等酪氨酸激酶能够引发Cav-1 的磷酸化，进而增强Cav-1 与P-gp 相互作用，抑制P-gp 外排活性，而下调Cav-1 表达则会增强P-gp 外排活性，说明Cav-1 对于P-gp 功能呈现负性调节作用。Dynamin 家族是一类鸟苷酸三磷酸酶（guanylate triphosphatase），是细胞在进行内呑（endocytosis）过程中的一种特异性蛋白，它参与囊泡从细胞膜上出芽和剪切的过程。有报道指出，磷酸化的Cav-1与dynamin 蛋白协同作用，可引导细胞微囊表面的内吞作用，与P-gp 形成的复合物因内吞作用被内化，导致了P-gp 的外排效果降低[44]。

4 结语

P-gp 部分定位在脂筏区域，其功能的调节与脂筏区域的脂质和蛋白环境有着密切关系。质膜上的胆固醇和鞘脂对P-gp 功能的发挥也起到一定影响[45-46]，脂筏作为质膜上脂质分子富集的区域，形成了有利于P-gp 信号转导和定位的细胞环境。在星形胶质细胞等细胞中均发现了关于P-gp 在小窝环境中的免疫标记，并与Cav-1 共定位，在耐去污剂的细胞膜结构中也证实了P-gp 同细胞骨架之间的联系[47]。此外，有研究报道，通过免疫沉淀证实ERM 蛋白家族与P-gp 共定位，并且作为连接P-gp 同肌动蛋白和细胞膜结构的支架蛋白一起存在于脂筏区[48]。ERM 蛋白的表达改变及磷酸化会影响P-gp 在膜上的表达，进而对跨膜运输作用产生直接影响，作为骨架蛋白，ERM 参与了P-gp 翻译后在质膜上的表达过程。Cav-1 蛋白作为构成脂筏区的主要调控蛋白，通过小窝蛋白结合基序在P-gp 的36 ～ 44 位氨基酸与P-gp 相互作用，导致P-gp 外排活性降低，对P-gp 的跨膜运输活性起到负向调节作用，磷酸化的Cav-1 会进一步加强这种作用。通过对ERM 和Cav-1 的研究，对于从质膜内的蛋白角度阐释P-gp在膜上功能和表达改变的机制提供了新的思路，对疾病状态下P-gp 的特异性改变提供了研究方向，对MDR 等现象开发抑制性药物提供了新的靶点。