新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验

范萃

摘要：2019冠状病毒病（2019-nCoV/SARS-CoV-2）疫情已成为国际关注的突发公共卫生事件。为应对突发病毒疫情事件，加快病毒检测并提高检测准确性变得非常重要。中华人民共和国国家卫生健康委员会《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》规定了核酸检测和基因测序作为确诊病例的方法，检测结果是对潜伏期人群、疑似病例人群和隔离期人群的新型冠状病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2）进行确诊的重要依据。本文对核酸检测结果判定及要点进行了分析，总结了经验并对未来发展进行了展望。

关键词：新型冠状病毒;核酸检测;经验总结

引言：

2019新型冠状病毒（2019-nCoV/SARS-CoV-2，以下简称新冠病毒）是一种新型β属冠状病毒，属于单链RNA病毒，可引起人类呼吸道感染，基因组序列约由29 kb构成，拥有10个基因，可有效编码10个蛋白。2019年12月突如其来的一场病毒疫情，引发对全球健康的关注，再次让我们体会重视生命，挽救生命的意义。在核酸检测过程中的各个环节中存在较多因素，本文将目前我院新冠病毒核酸检测中的部分环节及其中可能影响核酸检测结果的部分因素进行描述。

一、新冠病毒核酸检测方法

在疫情初期，我国最早采用的是高通量PCR检测技术。随着疫情的发展，这种检测技术无法在国内大量推广。随之而来，很多的厂家推出了基于实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术的试剂盒，这种检测技术在国家卫建委的推动下得到了很大的推广和应用。目前我院新冠病毒核酸检测针对的位点主要包含病毒基因组中2段保守基因序列，即以开放读码框1ab（ORF1ab）、 核 壳 蛋 白 （N）基因作为检测靶标[4]。

二、新冠病毒核酸检测样本核酸提取方法及病毒核酸检出情况

由于目前临床常见鼻咽拭子样本存在核酸检出率较低的问题，对提取方法及提取流程进行有实验数据依据的选择及优化是有必要的。新冠病毒核酸检测所采用的实时荧光定量PCR是临床分子检测中常用的检测方法，在以往采用RT-PCR对病毒核酸进行的检测中，磁珠法是较为常用的核酸提取方法。此外因各检测试剂盒要求，一步裂解释放法也在临床大量应用。不同的病毒核酸提取方法因其提取产物浓度、纯度的差别及对RNA的保护程度不同，一定程度上影响病毒核酸尤其是临界阳性样本的核酸检出。经过我们自己初始实验，对我院7例已确诊患者原始样本（均为生理盐水保存液的鼻咽拭子样本）同时采用不同提取方法后的核酸检测结果显示，分别采用一步裂解释放法及磁珠法提取后，PCR检测的CT值无显著差异（P>0.05）。

三、核酸检测结果判定及要点分析

新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第五版），简称”指南”中，核酸检测实时荧光RT.PCR方法，主要是对ORFlab和N两个靶标进行测定。采用同一份标本进行检测，当实时荧光RT-PCR检测的这两个靶标出现结果均为阳性时，确认为阳性病例;若单个靶标是阳性检测结果，需要重新进行实验，从采样开始再次进行实时荧光RT-PCR检测，检测结果依旧是单个靶标阳性检测结果，则确认为阳性。

第二种现象是，当以两种标本进行实时荧光RT-PCR检测同时出现单靶标阳性结果，确认为阳性病例;当同种类型标本经过2次采样检测，2次单个靶标均为阳性检测结果，可判定为阳性病例。当出现核酸检测结果阴性时，为防止判定错误，需要对检测的影响因素进行认真排除，避免产生假阴性。产生假阴性的主要因素包括：样本质量差，比如口咽等部位的呼吸道样本采样质量不好，有的没有采到带有病毒的上皮细胞，病毒含量低;样本收集时间把控不好，过早或过晚;样本采集后的保存不当，温度过高、保存时间过长;运输和处理样本不正确操作;检测中技术问题的原因，如没有考虑到病毒变异、PCR抑制等。

当出现不可确定的可疑情况，应采用多种方法多种试剂重复实验，或采用敏感度更高的方法，如数字PCR方法进一步确定。当根据指南Ct值判断时，规定的是无Ct值或Ct>40结果判断为阴性结果;Ct值<37，为阳性;当Ct值在37-40灰度区间时，建议重复做实验，若重做结果ct值<40，扩增曲线有明显起峰，则判断该标本为阳性，否则为阴性结果。需要强调的是，对病毒量低的标本进行病毒2019-nCoV/SARS-CoV-2核酸检测，特别是潜伏期、疑似病例人员，更加需要仔细了解试剂盒的检出限进行实验;应结合标本可能的病毒量选择具有不同检出限的试剂盒，并在检测时注意影响因素，并可使用数字PCR方法进一步确定，避免由于病毒量少而检不出的现象，最终获得准确的检测结果。

四、经验总结及展望

综上所述，目前新冠病毒所致疾病其病理生理过程还未完全阐明，全国各临床实验室检测方式未标准化，然而核酸检测也有其局限性，加上其核酸检测试剂盒研发时间紧迫，没有足够的评估及大样本的临床验证，同时也存在不同品牌产品的核酸试剂盒RT-PCR分析方法检测结果会有不同，检测效果良莠不齐，故对于临床上新冠病毒核酸检测结果为阴性或单通道阳性的样本均需要谨慎对待，考虑到各环节中可能造成结果不准确的影响因素。各临床实验室应在现有指南和相关研究报道的基础上，根据自身实验室情况对新冠病毒核酸检测全过程实施严格的质量控制、制定合理的优化自己的标准操作流程。同时，目前实验室已开始检测新冠病毒IgM及IgG抗体，更灵敏的核酸检测方法如数字PCR也开始应用于新冠病毒的核酸检测，部分研究团队着力于探索更加高效的新冠病毒实验室诊斷模型，有望在新冠病毒的实验室检测方面大大降低假阴性率;部分研究团队着力探索如何更快更便捷的开展新型冠状病毒核酸检测技术，为更好更快地确诊和筛查新冠病毒感染者提供事实依据。

参考文献：

[1]国家卫生健康委.新型冠狀病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）[EB/OL].http：//www.cntcm.com.cn/2020-03/05/content_72030.htm，2020-03-05.

[2]高亭，徐仰玲，何小鹏，等.40例新型冠状病毒肺炎的流行病学及临床特征分析[J].中国呼吸与危重监护杂志，2020，19（02）：148-153.

[3]王旭东，施健，丁伟峰，等.2019新型冠状病毒核酸检测的研究状况与应用探讨[J].临床检验杂志，2020，38（02）：81-84.

[4]钟慧钰，赵珍珍，宋兴勃，等.新型冠状病毒核酸临床检测要点及经验[J].国际检验医学杂志，2020，41（5）：523-526.

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